厚朴冷浸液对白色念珠菌生物膜作用的体外研究

向晓波，周艳萌，冯琳颖，董　华

(1.遵义医学院附属口腔医院 口腔外科,贵州 遵义　563099；2.遵义医学院 微生物与免疫学教研室，贵州 遵义　563099；3.遵义医学院 医学与科技学院，贵州 遵义　563099)



临床医学研究

厚朴冷浸液对白色念珠菌生物膜作用的体外研究

向晓波1，周艳萌2，冯琳颖3，董华3

(1.遵义医学院附属口腔医院 口腔外科,贵州 遵义563099；2.遵义医学院 微生物与免疫学教研室，贵州 遵义563099；3.遵义医学院 医学与科技学院，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 观察厚朴冷浸液对白色念珠菌(Candida albicans)黏附性及生物膜形成的影响，以探讨其能否用于治疗白色念珠菌相关龋病。方法 运用微孔板法复制白色念珠菌体外黏附及生物膜模型，采用XTT减低法评价不同浓度厚朴冷浸液对白色念珠菌黏附、生物膜形成的影响；光镜下观察生物膜内白色念珠菌形态学变化。结果 厚朴冷浸液对白色念珠菌的黏附具有抑制作用，在同一时间点其抑制作用具有浓度依赖性，但是随着时间延长，各组药物对白色念珠菌的黏附作用均减弱；厚朴冷浸液对白色念珠菌形成的生物膜具有抑制作用，其作用具有浓度依赖性，除7.80 mg/L浓度组外，其余各组与阴性对照组相比均有统计学意义(P< 0.05),125.00 mg/L浓度组对生物膜的抑制率达到60.27%；厚朴冷浸液使生物膜内白色念珠菌脱落，芽管形成受抑制。结论 厚朴冷浸液对白色念珠菌早期黏附和中期生物膜形成有抑制作用。

[关键词]厚朴；白色念珠菌；黏附；生物膜；龋病

龋病(dental caries)俗称虫牙、蛀牙，是多种因素作用下发生于口腔硬组织的慢性细菌性疾病，是口腔常见疾病，也是人类最普遍的疾病之一。龋洞中的微生物都是以牙菌斑生物膜的形式定植在龋洞中[1]，然而在龋洞中主要的致龋菌除了变形链球菌、乳酸杆菌、放线菌等，还存在一定数量的真菌，其中白色念珠菌(C.albicas)占优势[2]，尤其在幼儿龋及无龋牙菌斑中白色念珠菌的检出率较高[3]，中老年人龋洞中的白色念珠菌检出率也很高[4]。同时，白色念珠菌也是再治疗根管中检出率最高的真菌[5]。厚朴为木兰科植物厚朴和凹叶厚朴的干燥树皮、根皮及枝皮，具有广谱抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗溃疡以及抗凝血等作用[6]。田玉珠等[7]研究发现厚朴活性成分之一的和厚朴酚对根管内白色念珠菌生物膜有抑制作用，但是厚朴对白色念珠菌有没有抑制作用未见报道。本试验拟通过微孔板法探讨厚朴冷浸液对白色念珠菌黏附、生物膜形成的影响，为厚朴冷浸液用于口腔治疗白色念珠菌相关龋病提供基础实验依据。

1材料与方法

1.1菌种白色念珠菌(C.albicas)标准株ATCC10231由遵义医学院医学微生物学与免疫学实验室馈赠。

1.2药物与试剂厚朴购于遵义医学院附属医院中药局。RPMI1640培养基(GIBCO公司), 酵母蛋白胨葡萄糖(YPD)液体培养基依据文献配制[8]。XTT(sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO，sigma公司，分析纯)。

1.3仪器96孔培养板(美国康宁公司)，DHP-9162型电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，MK3酶标仪(美国，Thermo公司)。

1.4方法

1.4.1C.albicas菌悬液的制备菌种先接种于沙氏培养基复苏、分离纯化，然后挑取单个菌落转种于YPD液体培养基中，30 ℃摇床培养过夜后，用PBS清洗3次，再用RPMI1640培养基稀释，麦氏比浊管调整菌液浓度至1×106个细胞/mL。

1.4.2厚朴冷浸液(相当于生药浓度为1 g/mL)的制备秤取厚朴粉末10 g，加三蒸水10 mL放4 ℃冰箱浸泡15 d，滤纸过滤除去不溶物质，用无菌滤器过滤，分装后放入-20 ℃冰箱保存备用。使用时用RPMI1640培养液按二倍稀释法将厚朴冷浸液稀释成以下浓度: 125.00、62.50、31.25、15.63和7.81 mg/L。

1.4.3药物抗白色念珠菌黏附作用的测定将菌液调整为1×106个细胞/mL浓度，按照100μL/孔的量接种于96孔板中，37 ℃分别培养1、2和3 h，吸弃培养基，PBS洗去未黏附的菌，加入上述各浓度药液100 μL/孔，每组设8个复孔，同时设阴性对照孔(仅含菌液)，37 ℃再培养24 h，XTT法检测490 nm时各孔的吸光度值(A值)，重复3次，取平均值。

1.4.4药物抗24 h白色念珠菌生物膜的测定将菌液调整为1×106个细胞/mL浓度，96孔板第2～10孔接种100 μL/孔，第11孔加入RPMI1640培养液100 μL，37℃培养24 h后，弃去培养基及浮菌，用PBS冲洗3次，于第2～9孔加入上述各浓度药液100 μL/孔，第10～11孔各加RPMI1640培养液100 μL(第10孔为阴性对照孔、11孔为空白对照孔)。继续培养24 h，XTT法检测波长490 nm处各孔吸光度(A值)。每个浓度组均设8个复孔，实验重复3次，计算抑菌率。抑制率=(阴性对照孔A值-实验组A值)/(阴性对照孔A值-空白对照孔A值)×100(%)[5]。

1.4.5厚朴冷浸液对生物膜型白色念珠菌形态结构的影响将上述浓度菌液加入24孔板内盖玻片上，37 ℃培养24 h，构建24 h白色念珠菌生物膜。24 h后弃去培养基及浮菌，用PBS冲洗3次，加入125.00 mg/L厚朴冷浸液1 mL/孔，阴性对照孔加入RPMI1640培养液1 mL/孔，37 ℃再培养24 h，光学显微镜直接观察生物膜型白色念珠菌形态结构的变化。

2结果

2.1不同浓度厚朴冷浸液对白色念珠菌黏附的影响厚朴冷浸液对白色念珠菌的黏附有抑制作用，在同一时间点其抑制作用具有浓度依赖性，但是随着时间延长，各组药物对白色念珠菌的黏附作用均减弱(见表1)。125 mg/L浓度组在各个时间点对白色念珠菌黏附均有明显抑制作用，与阴性对照组相比有统计学意义(P<0.05)。而其余各浓度组仅在1 h时对白色念珠菌黏附均有明显抑制作用，与阴性对照组相比有统计学意义(P<0.05)。

组别厚朴冷浸液浓度(mg/L)厚朴冷浸液处理时间(h)1A值抑制率(%)2A值抑制率(%)3A值抑制率(%)阴性对照组00.38±0.04—0.35±0.06—0.45±0.05—厚朴冷浸液组125.000.22±0.03*42.370.27±0.06*23.850.37±0.05*16.8362.500.24±0.04*30.420.29±0.0517.320.40±0.0811.7131.250.25±0.03*33.200.30±0.0314.960.40±0.0512.0015.630.27±0.07*30.220.31±0.0612.750.42±0.036.137.810.30±0.09*19.920.33±0.055.930.42±0.026.50

*与阴性对照组比较，P< 0.05。

2.2不同浓度厚朴冷浸液对白色念珠菌生物膜形成的影响厚朴冷浸液对白色念珠菌形成的生物膜具有抑制作用，其作用具有浓度依赖性，除7.8 mg/L浓度组外，其余各组与阴性对照组相比均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

药物浓度(mg/L)A值抑制率(%)00.37±0.05—125.000.15±0.02*60.2762.500.23±0.06*38.5831.250.22±0.04*40.7815.630.23±0.04*38.457.810.30±0.0518.95

*与阴性对照组比较，P<0.05。

2.3厚朴冷浸液对生物膜型白色念珠菌形态结构的影响光镜下，真菌对照组形成良好的生物膜，膜内白色念珠菌主要表现为菌丝相，形态规则，假菌丝交织成网状(见图1A)。厚朴冷浸液组生物膜结构受到破坏，一些区域的白色念珠菌已经脱落，膜内白色念珠菌的数量明显减少，芽管、假菌丝形成较对照组明显减少，芽管形态不规则(见图1B)。

A：真菌对照组；B：厚朴冷浸液组。图1　不同组别的生物膜型白色念珠菌形态结构(×400)

3讨论

白色念珠菌是临床最常见的条件致病真菌，调查结果显示念珠菌感染占真菌感染的73.4%，其中白念珠菌感染最常见[9]。目前国内治疗白色念珠菌感染的常用药物包括氟康唑、制霉菌素等，但是由于临床上长期应用，白色念珠菌的耐药菌株不断出现。大量研究表明，中药在抗真菌感染中具有一定优势[10]。许多学者研究发现单味中药、中药方剂、中药有效成分如牡丹皮[11]、黄连解毒汤[12]、紫檀芪[8]等对白色念珠菌生物膜均具有抑制作用。生物膜的形成经历了黏附、微菌落形成、微菌落融合、生物膜形成与生物膜成熟等阶段，其中黏附是生物膜形成至关重要的一步，故抑制黏附是抗白色念珠菌生物膜感染的关键措施[13]。而白色念珠菌的酵母态和菌丝态间的可逆转换对其致病性及生物膜的形成过程也起着重要作用，菌丝态对于维持成熟生物膜结构的完整性和维持多层体系是非常重要的[14]。

本试验采用微孔板法观察不同浓度的厚朴冷浸液对白色念珠菌黏附的影响，发现实验所取5个浓度组在1 h抗黏附试验中对白色念珠菌的黏附均有明显抑制作用(P<0.05)，并且作用具有浓度依赖性。但是随着时间延长，作用减弱。试验采用微孔板法复制生物膜体外模型，观察不同浓度的厚朴冷浸液对白色念珠菌24 h生物膜的影响，发现实验所选5个浓度对白色念珠菌的生物膜均有抑制作用，最高浓度125 mg/L组对白色念珠菌生物膜的抑制率达到了60.27%。同时光镜下观察到对照组形成良好的白色念珠菌生物膜，膜内白色念珠菌主要表现为菌丝相，这是白色念珠菌成膜的关键。厚朴冷浸液组生物膜结构受到破坏，膜内白色念珠菌出现脱落，菌量明显减少，芽管、假菌丝形成较对照组明显减少，芽管形态不规则。本实验证明了厚朴冷浸液能够抑制白色念珠菌早期的黏附和其芽管的形成，从而影响生物膜形成，但其通过哪些机制影响黏附和芽管形成还需进一步证实。

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[收稿2015-11-11;修回2015-12-14]

(编辑：王福军)

Effects ofmagnoliaecortexquenching liquid oncandidaalbicansbiofilm

XiangXiaobo1,ZhouYanmeng2,FengLinying3,DongHua3

(1.Department of Stomatological Surgery,The Affiliated Stomatology Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Department of Microbiology and Immunology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3.Medicine&Technology School, Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To observe the impact of Magnoliae cortex quenching liquidon Candida albicans adhesion and biofilm formation in order to assess its anti-caries effect.Methods The 96-well microtiter plates were used to produce C. albicans in vitro adhesion and biofilm model, XTT reduction assay was applied to evaluate the effect of the different concentrations of Magnoliae cortex quenching liquid on C. albicans adhesion and biofilm formation. Light microscope was employed to observe the morphological changes of Candida albicans in biofilm. Results Magnoliae cortex quenching liquid had inhibitory effect on C. albicans adhesion, its action was concentration-dependent at the same time point. However, with the time prolonged, the drug for C. albicans adhesion effect weakened. Magnoliae cortex quenching liquid had inhibitory effect on C. albicans biofilm formation; its action was concentration dependent.Compared with negative control group had statistical significance (P﹤0.05) in addition to the concentration of 7.8 mg/l group. Concentration of 125.00 mg/l group of inhibition rate reached 60.27 %. Magnoliae cortex quenching liquid led to C. albicansin the biofilm shedding and inhibited germ tubes formation. Conclusion Magnoliae cortex quenching liquid has inhibitory effect on C. albicans early adhesion and middle of biofilm formation.

[Key words]magnoliae cortex; candida albicans; adhesion; biofilm; dental caries

[中图法分类号]R379.4

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)01-0051-03

[基金项目]贵州省中医药管理局资助项目(NO：ky2015-9)。