道真洛龙党参多糖对小鼠免疫活性的影响

余　兰，王　毅

(遵义医学院药学院 分析化学教研室，贵州 遵义　563099)



基础医学研究

道真洛龙党参多糖对小鼠免疫活性的影响

余兰，王毅

(遵义医学院药学院 分析化学教研室，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 探讨从遵义道真洛龙党参中提取的党参多糖对小鼠免疫活性的影响。方法 采用水溶剂煎煮提取、乙醇沉淀及Sevage法去蛋白制备道真洛龙党参多糖(COP-1、COP-2、COP-3)，环磷酰胺作为免疫抑制剂进行腹腔注射，建立免疫功能低下动物模型，灌胃道真洛龙党参多糖，测定小鼠碳粒廓清速率、胸腺、脾脏指数。昆明种雄性小鼠随机分成正常对照组、模型组、阳性药组、道真洛龙党参多糖COP-1、COP-2、COP-3组共6组，每组12只，环磷酰胺造模，多糖灌胃，7 d后测定小鼠胸腺及脾脏指数。结果 模型组中小鼠脾脏和胸腺指数较正常对照组降低(P<0.01)，阳性药组、道真洛龙党参多糖COP-1、COP-2、COP-3组的小鼠胸腺和脾脏指数均较高于模型组(P<0.01)。结论 道真洛龙党参多糖可减轻环磷酰胺所致小鼠免疫功能抑制，不同分子量党参多糖对环磷酰胺诱导的小鼠遗传物改变具有拮抗作用。

[关键词]道真洛龙党参多糖；免疫；小鼠；碳粒廓清速率；脾脏；胸腺

党参是桔梗科植物党参，包含素花党参与川党参的干燥根。其性味甘平、无毒，是我国传统补益药，具有补中益气、健脾益肺之功效[1]，主要产于贵州、四川、山西等地。党参的成分复杂，主要含有多糖、党参皂苷、生物碱类、甾体类、萜类等成分[2]。党参被用来治疗脾肺气虚，气血不足，心悸气短，内热消渴等症状的疾病，其中党参多糖具有增强小鼠体力和非特异性免疫、抗疲劳、抗缺氧、抗应激和抗衰老等功能，且对正常细胞无毒副作用[3]。

“洛龙党参”产于贵州省遵义市道真县洛龙镇，是川党参(CodonopsistangshenOliv.)的生态型变种，是贵州省著名的特有药材，质量优良[4]。目前，有关道真洛龙党参多糖免疫调节作用的研究还较少，龚其海等[5]报道了道真洛龙党参及其移栽到其他地区同品种党参所含多糖均可减轻环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)所致小鼠免疫功能抑制，并且异地移栽后的洛龙党参所含多糖具有免疫功能增强的作用，然而未对不同剂量和分子量的党参进行系统研究。为此，本研究以道真洛龙党参为药材，提取分离粗多糖后对其组成进行纯化分析，获得不同分子量的洛龙党参多糖。研究观察不同分子量的道真洛龙党参多糖对环磷酰胺药物所引起的小鼠免疫器官损伤的影响，以期为道真洛龙党参资源的开发利用提供一定参考。

1材料与方法

1.1实验动物昆明种小鼠共72只，雌雄各半，每只(20±2)g，SPF级，由中国人民解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(渝)2012-0006。

1.2主要药品及试剂无血清1640培养基(Gibco公司)，环磷酰胺(CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司)，黄芪颗粒(贵州汉方制药有限公司)，印度墨汁(南京都莱生物技术有限公司)，道真洛龙党参(购于遵义市道真县洛龙镇党参种植户，并经遵义医学院药学院生药学教研室鉴定为真品)。

1.3主要仪器MSA125P-100DU型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]，T9型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，R-205型旋蒸蒸发仪(瑞典Buch公司)，Modulyod 0230型冷冻干燥机(美国赛默飞科技有限公司)。

1.4道真洛龙党参多糖的提取与纯化将从道真苗族仡佬族自治县洛龙乡采集的新鲜党参根晒干、洗净、切片、烘干，制成党参饮片。道真洛龙多糖提取方法参见中国发明专利申请公布号CN104147042 A，得到不同分子量的道真洛龙党参多糖COP-1、COP-2、COP-3[6]，其分子质量分别3 500、7 000、10 000左右。总糖含量采用苯酚-硫酸法[7]测定，测得总糖含量为92.18%。

1.5动物分组和处理72只雌雄各半的昆明种小鼠(20±2)g，随机分为正常对照组、模型组、道真洛龙党参多糖COP-1低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性药组共6组，每组12只小鼠。除正常对照组外，小鼠采用腹腔注射环磷酰胺粉针剂100 mg/kg的剂量，腹腔注射诱导免疫抑制小鼠模型，1次/d，注射3次，其中正常对照组注射生理盐水。造模后，连续给药7 d，1次/d。阳性给药组给予黄芪颗粒灌胃，剂量为200 mg/kg；道真洛龙多糖低剂量组、中剂量组及高剂量组分别给予400、600、800 mg/kg的党参多糖灌胃。给予同体积的生理盐水灌胃模型组、正常对照组。

1.6测定小鼠静注碳粒廓清速率末次给药24 h后小鼠进行称重，将1%明胶溶液稀释5倍的印度墨汁对小鼠尾静脉注射，注射量为0.1 mL/10g，分别在5 min(t1)、10 min(t2)时取小鼠外周血。在8 mL的0.1% CaCO3溶液中加入80 μL小鼠外周血液，然后在分光光度计680 nm处测定此溶液的吸光度A1、A2，并计算小鼠碳粒廓清指数K。第2次取血后将小鼠断椎处死，无菌条件下取出肝、脾、胸腺，用生理盐水冲洗，吸干称重，计算吞噬指数α。碳粒廓清指数(K)= lgA2- lgA1/(t2-t1)，α=体重/(脾重+肝重)×K1/3。

1.7小鼠脾脏指数、胸腺指数的计算按照1.6中处理，称重，计算小鼠脾脏指数、胸腺指数。计算公式: 脾脏指数=(脾脏重量/小鼠体重)×10，胸腺指数=(胸腺重量/小鼠体重)×10。

2结果

2.1不同剂量的道真洛龙党参多糖(COP-1)对小鼠免疫系统的影响

2.1.1COP-1对小鼠注碳粒廓清速率和吞噬指数的影响小鼠外周血取样，按照公式计算小鼠的注碳粒廓清率K和吞噬指数α，实验结果发现，模型组K和α指标均低于正常对照组(P<0.01)，但道真洛龙党参多糖COP-1中、高剂量组和阳性药组的α与K均高于模型组(P<0.01)。其中道真洛龙党参多糖COP-1中剂量组和高剂量组相互的差异不显著(见表1)。

组别剂量(mg/kg)静注碳粒廓清速率K吞噬指数α脾脏指数胸腺指数正常对照组—0.027±0.0105.42±1.023.43±0.733.19±1.28模型组—0.010±0.006**3.67±0.73**1.82±0.55**1.08±0.26**黄芪颗粒药组2000.021±0.002##5.27±0.21##6.21±2.04##1.84±0.51##COP-1低4000.022±0.0184.12±2.432.82±0.871.39±0.47COP-1中6000.021±0.012##4.51±1.83#4.68±1.11##1.97±0.02##COP-1高8000.024±0.019##4.73±1.19##4.19±1.83##1.99±0.07##

**：与正常对照组比较，P<0.01；#：与模型组比较，P<0.05；##：与模型组比较，P<0.01。

2.1.2COP-1对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响小鼠处死取材后按照公式计算脾脏指数和胸腺指数。模型组小鼠的脾脏指数和胸腺指数明显低于正常对照组小鼠(P<0.01)，阳性药，中剂量及高剂量组的脏器指标均明显高于模型组(P<0.01)，其中道真洛龙党参多糖COP-1中剂量组和高剂量组的相互差异并不显著(见表1)。

2.2不同分子质量的道真洛龙党参多糖(COP-1、COP-2、COP-3)对小鼠免疫系统的影响小鼠处死取材后按公式计算胸腺指数和脾脏指数。模型组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均显著低于正常对照组(P<0.01)，阳性药组、COP-1药组、COP-2药组、COP-3药组的脾脏指数和胸腺指数均高于模型组(P<0.01)，而COP-1、COP-2、COP-3组间未见统计学差异(见表2)。

组别剂量(mg/kg) 胸腺指数脾脏指数正常对照组—3.05±1.223.27±0.81模型组—1.14±0.29**1.73±0.57**黄芪颗粒药组2001.84±0.51##6.21±2.04##COP-16001.97±0.02##4.68±1.11##COP-26001.71±0.12##4.26±1.33##COP-36001.92±0.27##4.59±1.65##

**：与正常对照组比较，P<0.01；##：与模型组比较，P<0.01。

3讨论

环磷酰胺对淋巴细胞具有明显抑制作用，常被作为免疫抑制剂使用，用此药建立免疫抑制动物模型[8-10]。小鼠静注碳粒廓清速率实验反映小鼠单核巨噬细胞的吞噬能力强弱，用注碳粒廓清指数速率(K)和吞噬指数来进行判定。注碳粒廓清指数速率愈大，小鼠单核巨噬细胞的吞噬活性愈强，清除静脉中异物的清除率高、迅速，吞噬功能愈强；反之则弱。本实验结果与相关文献报道一致[11]。体内的脾脏与胸腺器官对机体免疫系统有着非常重要的影响，脾脏与胸腺器官相对质量的变化能够作为评价机体免疫的表征，其高低取决于其中淋巴细胞增殖的程度，可估计免疫功能的强弱。实验结果表明，正常昆明种小鼠采用环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠模型，造模后，测量小鼠的体重及脾脏、胸腺指数与正常对照组小鼠对比，数值均明显下降，说明免疫抑制动物模型造模成功。黄芪颗粒药组胸腺指数和脾脏指数均高于模型组(P<0.01)，说明选择的阳性对照药能显著性地增强小鼠的免疫功能，而与正常组对照，胸腺指数显著降低而脾脏指数显著增强(P<0.01)，这可能与黄芪颗粒对小鼠免疫活性的具体作用靶点不一致所致，需要进一步的研究证实。

龚其海等[5]文献报道，道真洛龙党参及其移栽后的洛龙党参所含粗多糖都对小鼠免疫功能有增强作用，说明经移栽后洛龙党参的党参粗多糖对小鼠免疫功能的影响未发生改变。本研究在其基础上进一步通过环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠模型，选用市售黄芪颗粒作为阳性对照，考察道真洛龙党参中提取、分离的不同分子量洛龙党参多糖(COP-1、COP-2、COP-3)的增强免疫功能作用。实验结果表明，道真洛龙党参多糖COP-1中剂量、高剂量组都具有与阳性对照药黄芪颗粒相似的增强免疫功能的效果，测量的小鼠碳粒廓清速率、脾脏指数和胸腺指数均明显高于模型组小鼠，表明了洛龙党参COP-1中剂量、高剂量组多糖均可减轻CTX所致小鼠免疫功能的抑制作用，但COP-1中剂量、高剂量组相互差异不显著。值得注意的是，不同分子量的党参多糖对于小鼠脏器指标的影响表明，COP-1、COP-2、COP-3均具有减轻CTX对小鼠免疫功能的抑制作用，但相互差异并不显著。提示道真洛龙党参多糖的主要活性部位可能是不同分子量的均一多糖协同作用的结果。

综上所述，本研究表面道真洛龙党参多糖COP-1、COP-2、COP-3对于小鼠的肝脏和脾脏器官活性有一定增强作用，能够抵抗CTX对小鼠免疫功能的抑制作用，促使免疫系统产生更多的免疫细胞，提高免疫抑制小鼠的免疫系统发挥作用，起到增强机体免疫作用的功效。

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[收稿2015-12-09;修回2016-01-03]

(编辑：王静)

Study on immunological activities of polysaccharides isolated fromRadixcodonopsison immune function in mice

YuLan，WangYi

(Department of Analytical Chemistry of School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To investigate the effects of purified polysaccharides from Luolong Radix codonopsis on depressed immune function induced by cyclophosphamide (CTX) in mice. Methods To extract and purify polysaccharides from Luolong Radix codonopsis. 72 mice were randomly divided into blank, model, positive (Astragalus membranaceus), low (400),medium (600), and high (800 mg/kg) dose groups of COP-1,and compared the efficacy of COP-1 (wt. 3 500), COP-2 (wt. 7 000), and COP-3 (wt 10 000) at 600 mg/kg daose．Model with depressed immune function was induced by cyclophosphamide at the dose of 100 mg /kg for consecutive 3 days，meanwhile polysaccharides were administrated by gavage 7 days later.The carbon clearance rate, thymus and spleen index were calculated to confirm the effects of polysaccharides on the depressed immune function.Results Thymus and spleen index of model group were significantly decreased. However, thymus，spleen index of positive，mid- and high-dose of COP-1, and different molecular weight groups of COP-1, COP-2,and COP-3 were significantly increased than those of model group. Conclusion Polysaccharides from Luolong Radix Codonopsis may attenuate the depression of immune function induced by CTX in mice，and different molecular weight polysaccharides were not statistically significant genetic material injury in mice induced by CTX.

[Key words]polysaccharides; immune function; mouse; carbon clearance rate; spleen; thymus

[中图法分类号]R979.5

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)01-0010-04

[基金项目]贵州省科技厅基金资助项目(NO：LH[2014]7563)；遵义医学院博士启动基金项目(NO：ZMKD2013-006)。