NF-κB信号通路研究进展＊

赵运旺，朱嘉宁

（西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州730070）

NF-κB信号通路研究进展＊

赵运旺，朱嘉宁△

（西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州730070）

转录因子NF-κB作为一个标准的可诱导的转录因子已经超过20年了。众多的可激活NF-κB的刺激，以及大量的受NF-κB调节的基因，确保了这一转录因子仍然是研究热点。在这里，我试图总结一下从这些NF-κB的研究中所浮现出的一些基本规律，并希望能找出一个较统一的关于NF-κB调节的观点。

NF-κB；信号通路；家族蛋白

1 NF-κB信号通路概述

NF-κB(nuclear factor-κB)是一种细胞核转录因子,因其能够与B细胞免疫球蛋白的κ轻链基因的增强子κB序列GGGRNWYYCC(N-任意碱基; R-嘌呤;W-腺嘌呤或胸腺嘧啶;Y-嘧啶)特异结合而得名[1-3]。NF-κB 调控一大类基因的表达,它调控的靶基因包括免疫相关受体、细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-12和TNF2α、LTα、LTβ、GM-CSF)、炎症因子 (IL-8、MIP-1α、MCP1)、黏附分子(ICAM、VCAM和E-selectin)、急性期蛋白(如SAA)等,在调控免疫细胞的激活、T、B淋巴细胞的发育、细胞凋亡、肿瘤形成、病毒复制、炎症反应及多种自身免疫性疾病方面发挥重要作用[4-5]。

NF-κB信号转导通路属于受调蛋白水解酶依赖的受体信号转导通路。在未受刺激的细胞中，NF-κB转录因子与抑制性I?B(InhibitorofkappaB)蛋白结合在一起，因而被滞留在细胞质中。上游信号的刺激导致IκB蛋白在IKK(IκB kinase)的作用下被磷酸化修饰，继而被泛素连接酶复合体识别，促使IκB蛋白以蛋白酶体依赖的方式被降解，NF-κB从而被释放出来，进入细胞核并启动靶基因的表达。

2 NF-κB信号通路的主要成员

2.1 NF-κB家族蛋白

NF-κB家族成员主要包括RelA(p65),c-Rel, RelB,NF-κB1(p50蛋白及其前体p105)和NF-κB2 (p52蛋白及其前体p100),各成员可形成同源或异源二聚体而行使功能。在哺乳动物细胞中最常见的是NF-κBp65与p50结合形成p65/p50二聚体。NF-κB家族蛋白的共同点是均含有一个高度保守的由大约300个氨基酸组成的结构域—Rel同源结构域（Relhomologydomain，简称RHD），该结构域与DNA结合、蛋白二聚化以及与IκB蛋白结合等功能有关。RHD 同时还含有核定位信号序列（nuclear localization signal，简称NLS），是活化的NF-κB进入细胞核所必需的，在细胞质中NF-κB与IκB蛋白结合，IκB掩蔽了NF-κB的NLS，使NF-κB滞留在胞质内，当IκB被降解后，NF-κB的NLS暴露，使NF-κB进入核内并与靶基因结合。不同的是RelA (p65),c-Rel,RelB的C端含有一个转录激活结构域（transactivationdomain，简称TAD），可以通过募集转录共激活物和移除转录阻碍物而促进转录；而NF-κB1和NF-κB2的C端则为多拷贝的锚蛋白重复序列（ankyrin repeats），该重复序列可以与RHD结构域结合，从而通过掩蔽核定位序列（NLS）抑制蛋白的入核，此外，NF-κB1和NF-κB2的前体蛋白可以通过有限剪切等方式转变成短的、有活性的蛋白形式。p52和p50的同源二聚体缺少TAD，因此没有真正的能力去驱使转录，事实上，在静息细胞中，p52和p50的同源二聚体抑制基因转录，但p52和p50可以通过与含TAD的NF-κB蛋白形成异源二聚体而起始转录。

通过遗传学实验的研究，我们对NF-κB家族蛋

白的功能有了更精确的了解，这些主要是通过基因敲除实验得到的，现在几乎所有的NF-κB家族成员的基因敲除小鼠都已经被报道，下面分别介绍NF-κB家族蛋白各个成员的功能。

遗传学研究显示p65在TNFα引起的细胞凋亡中起到关键性的保护作用。P65-/-小鼠在胚胎发生期E14-E15时，由于TNFα诱导大量发育中的肝细胞发生凋亡而死亡。P65-/-TNFα-/-或p65-/-TNFR-/-双敲除的小鼠在TNFα诱导下没有出现大范围的肝细胞凋亡，仍然可以正常发育，可以研究在其它组织中p65敲除的影响。但p65-/-TNFR-/-双敲除的小鼠对细菌感染的易感性增强，所以出生后死亡率很高，这也提醒我们注意p65在固有免疫应答中的作用和由非造血系统细胞起始的固有免疫应答。除了抑制TNFα介导的肝细胞的凋亡之外，p65还能保护很多其他类型的细胞免受TNFα的毒性影响，包括巨噬细胞、B细胞、和T细胞。同时，p65的抗凋亡的功能也不仅局限于对TNFα刺激的应答，有研究表明p65也可以保护双链RNA（dsRNA）引起的细胞死亡[6]。P65的抗凋亡功能与它能够诱导许多抑制凋亡的靶基因表达有关，包括c-FLIP、cIAP1、cIAP2、A20、GADD45β和MnSOD等[7]。此外在嵌合鼠模型中，p65的敲除实验还显示出其在各种刺激下的B细胞和淋巴细胞增殖时的类别转换中发挥重要作用。

p50蛋白是由 NFKB1基因编码的，并通过p105前体蛋白剪切而成。p105蛋白转变成p50蛋白的过程似乎是细胞中持续发生的，从而可以提供充足且成熟的p50亚基，并与其它NF-κB家族蛋白形成二聚体[8]。p105蛋白通过限制性的蛋白酶水解产生p50的过程，依赖于一个在氨基酸376～404之间的甘氨酸富集区（GRR），它是一个蛋白水解的终止信号。与p65敲除小鼠不同，p50缺失小鼠没有任何发育缺陷。p50-/-小鼠表现出免疫球蛋白产量下降并存在体液免疫应答缺陷。

p52/p100蛋白是由NFKB2基因编码的，p52蛋白来自于p100蛋白诱导后剪切的N端部分，它是与RelB形成异源二聚体的主要亚基。p100蛋白被剪切成p52蛋白是受上游信号严格调控的，只有在某些特定的刺激下（如某些TNFR家族蛋白的激活）才会发生，在未受刺激的细胞中仅有极少的p100的组成型加工处理。p100的加工处理过程首先是由NIK（NF-κB-inducing kinase）活化IKK(IκB kinase) α，激活的IKKα促使p100的磷酸化，从而募集SCFβTrCP，导致p100的Lys855的多聚泛素化，再经过蛋白酶体的剪切产生成熟的p52蛋白。有研究显示在此过程中，NIK不仅是IKKα的激酶而且是一个连接IKKα和p100的对接蛋白。此外，p100的C端死亡区（DD）可能是一个加工处理过程的抑制区，缺失此区的p100表现出增加的组成型加工处理。同p105，p100的GRR区对于部分处理产生p52和释放活化的p52：NF-κB复合体也是必需的。p52-/-小鼠不能正常发育出B细胞囊泡、生发中心并且脾的结构和派伊尔结（Peyer’spatches）的发育有缺陷[9-11]，此外还表现出不正常的T细胞功能。类似的免疫系统缺陷也发生在缺失淋巴毒素β（lymphotoxinβ，简称LTβ）、淋巴毒素β受体（lymphotoxinβreceptor,简称 LTβR）、NF-κB诱导激酶 （NF-κB-inducing kinase，简称NIK）或RelB的小鼠中[12]。上述结果表明，这些基因的表达产物可能共同参与LTβR诱导的信号途径。总之，p52敲除小鼠的表型与p52在LTβR诱导的信号途径中的作用一致，尤其是与次级淋巴器官的发育有关。

RelB的独特之处在于不能形成同源二聚体，也不与c-Rel或p65形成异源二聚体，它仅与p100，p52，p50形成异源二聚体，且除了与p100相互作用外不与其它I-κB蛋白作用。只有胸腺、淋巴结和派伊尔结（Peyer’s patches）的特定区域才能检测到RelB的大量表达。与它的表达分布一致的是，RelB的主要功能是促进次级淋巴结构的形成和调节免疫应答中某些类型细胞的发育和功能。研究表明，RelB:p52二聚体表现出组成型的核定位，而且RelB参与多种组织中NF-κB的组成型激活。RelB-/-小鼠的胸腺和脾脏细胞中表现出NF-κB活性的下降，并且使多种器官中的炎性浸润增强，适应性免疫应答也有严重缺陷，如果p50也敲除，这种表型会更加明显，这表明p50和RelB共同调节限制炎症的基因的表达。各种研究显示，RelB对于淋巴器官的发生很重要，尤其是派伊尔结的发育，这些发现使人们开始关注RelB：P52在淋巴器官发生中的作用（很可能是通过LTβR信号通路）。

c-Rel可以形成同源二聚体，也可以与p65或p50形成异源二聚体。c-Rel-/-小鼠不能产生有价值的体液免疫应答，并且外周的T、B细胞对典型的抗原刺激不应答。缺少c-Rel的TAD区，但有完整的

RHD区的小鼠表现出更严重的表型，如次级淋巴器官显著增生和骨髓增生。表明c-Rel对机体的免疫调节可能具有重要的作用。

以上主要通过基因敲除的研究结果讨论了NF-κB各亚基蛋白的功能，但是由于NF-κB各亚基之间可能具有功能上的重叠性以及相关性，所以单独敲除一个亚基的基因可能不能完全表现出该基因的功能。多亚基敲除的实验可以帮助我们更深入地研究NF-κB转录因子的功能，并且已有研究表明，多亚基缺失的小鼠确实表现出新的表型或者更加严重的病理症状[12]。

2.2 IκB家族蛋白

NF-κB抑制因子(InhibitorofkappaB,I-κBs)是一类NF-κB抑制蛋白,其中包括IκBα、IκBβ、IκBλ、IκBε、IκBNS、Bcl-3、IκBζ以及果蝇的Cactus蛋白等亚基，它们的分子中都含有五到七个在进化上很保守的锚蛋白重复序列，该重复序列可以通过与NF-κB的RHD结构域结合，掩蔽NF-κB的核定位序列，从而使NF-κB滞留在胞质中。另外，IκB家族中还包括一些不具有抑制NF-κB活化功能的蛋白，如Bcl-3和IκBζ等。下面分别介绍一下各亚基的功能。

静息状态下IκBα通过与NF-κB转录因子的结合掩蔽了NF-κB二聚体的核定位信号，同时也干扰了NF-κB与DNA的结合，从而阻抑了NF-κB的转录功能。NF-κB信号通路可被多种外来信号如TNFα、生长因子、细胞因子、淋巴因子、紫外线、药物、压力等激活。在外来信号的作用下,IκBα蛋白N端的两个保守的丝氨酸Ser32和Ser36被IKKβ磷酸化，继而被SCFβ-TrCPE3泛素连接酶复合体识别，从而促使IκBα分子中的Lys21及Lys22位点被泛素化修饰，并被26S蛋白酶体识别和快速降解。NF-κB被释放出来并进入细胞核，与特定基因的启动子区域结合，从而启动靶基因的转录。IκBα-/-小鼠表现出增强的NF-αB的DNA结合活性，但并不是组成性的，说明p65:p50二聚体可能还受到其它机制的调控。新合成的IκBα参与反馈调节从而阻止NF-κB的进一步激活，与此一致，IκBα-/-小鼠在TNF-α刺激下的NF-κB信号通路的结束显著推迟。

IκBβ和IκBε的功能与IκBα相似，只是与不同的NF-κB二聚体的亲和力不同，而且它们也受蛋白N端位点的磷酸化调控，如IκBβ的丝氨酸Ser19和 Ser23被IKKβ磷酸化，但是磷酸化和降解的动力学反应比IκBα要慢得多，可能是由于上游IKK激酶复合物与底物IκB的亲和力差异等原因造成的。研究显示，IκBε含有一个非经典的NES，是c-Rel和IκBε返回胞质所必需的，而且由于IκBε是在NF-κB激活后诱导的，因此它可能在调节NF-κB晚期基因的激活方面起一定作用。

Bcl-3和IκBζ与经典的IκBs蛋白不同，而且与其他IκBs的同源性很差。Bcl-3可能作为共激活因子与p50（或p52）同源二聚体特异性结合，形成转录激活复合体，促进转录，解除p50（或p52）同源二聚体的抑制作用。Bcl-3-/-小鼠可存活，但对于各种病原体无法产生合适的体液免疫应答，它们缺少脾生发中心，但血清抗体水平正常，并且无抗原特异性应答，表型部分与p52-/-相似，也支持了Bcl-3与p52同源二聚体结合形成转录激活复合体，IκBζ可能促进一系列NF-κB靶基因（如IL-6等）的活化[13]，但没有其它直接证据证明它是IκB家族的有功能的成员，并且未显示其与Rel家族成员相互作用。

2.3 IKK蛋白

IKK(IκBkinase)，它可以使NF-κB的抑制者IκB磷酸化，随后引起IκB的泛素化和蛋白酶的降解，释放和活化NF-κB。IKK主要以IKK复合体的形式发挥作用，IKK复合体主要包括IKKα（IKK1）、IKKβ（IKK2）和NEMO（NF-κBessential modulator，也叫IKKγ、IKKAP1、Fip-3），其中IKKα和IKKβ是催化亚基，NEMO是调节亚基。IKKα、IKKβ是一类丝/苏氨酸激酶，N端含一个蛋白激酶结构域，C端是螺旋-环-螺旋结构域 （HLH）和亮氨酸拉链结构域（LZ），NEMO是一个分子量约为48KDa的蛋白，与IKKα、IKKβ不同，它的N端和C端含有大量的卷曲螺旋结构（CC），C端还有一个锌指样结构域（ZF）和一个亮氨酸拉链结构域（LZ）。IKKα、IKKβ的二聚化依赖于LZ结构域，而且此结构域对于其的激酶活性也有贡献。HLH结构域对于IKK的激活是必须的，而且它和IKK激酶活性的负调控有关。IKKα、IKKβ与NEMO的作用是通过C端的六肽序列（Leu-Asp-Trp-Ser-Trp-Leu），即 NBD（NEMO binding domain）实现的。NEMO也能通过其CC和LZ结构域形成多聚体，主要是三聚体或四聚体。由于 IKK复合体中存在两个 IKKα/IKKβ二聚体，NEMO很可能是以四聚体的形式存在的。组装IKK

复合体时，NEMO通过其N端的CC结构域与IKKβ的C端的NBD结构域结合，而且有研究显示，移除HLH结构域，IKK与NEMO无法结合，这说明HLH结构域可能促进IKK与NEMO的装配。IKKα和IKKβ的序列具有很高的同源性，其全部序列有52%的同源性，催化区有65%的同源性。IKKα、IKKβ和IKKγ的蛋白分子量总和约为220kDa，但IKK复合体的分子量约为700～900KDa，这说明IKK复合体中还有其他组分，或IKK复合体中的亚基以聚合体的形式存在。下面分别介绍一下IKK复合物各亚基的功能。

IKKβ亚基主要在TNF、IL-1和LPS等诱导的促炎反应信号通路中行使磷酸化IκB蛋白的功能，是IKK复合物的主要的催化亚基，而且是快速激活NF-κB所必需的。IKKβ能特异地磷酸化IκBα、IκBβ和IκBε分子中特定的Ser残基。以IκBα为例，IKKβ活化后将IκBα的Ser32和Ser36两个位点磷酸化，IκBα随即被E3泛素连接酶识别并导致26S蛋白酶体依赖的降解，从而使NF-κB二聚体被释放并活化，这条信号转导途径叫做NF-κB激活的经典信号途径。IKKβ-/-小鼠由于肝细胞发生凋亡，在胚胎发育的E12.5-E14.5天时死亡，这与p65-/-及p65-/-p50-/-基因敲除小鼠的表型一致。IKKβ-/-细胞比野生型细胞对TNFα诱导的凋亡更加敏感，而且TNFα、IL-1和dsRNA等刺激不能诱导IKKβ-/-细胞中NF-κB的活化。IKKβ+/-细胞中IKKβ的表达量降低了一半，导致IKK的激酶活性降低了～50%，NF-κB的活性则降低了～70%～80%。IKKβ-/-TNFR-/-双敲除小鼠在细菌感染的固有免疫应答中存在明显缺陷，出生后仅存活几天，但p65-/-TNFR-/-双敲除小鼠可存活数月，这说明IKKβ的作用不能被IKKα或其它激酶补偿。以上结果都表明IKKβ是固有免疫和炎症反应等过程中激活NF-κB所必需的蛋白激酶，主要在NF-κB的经典途径中发挥作用。

虽然IKKα和IKKβ的的序列有很高的相似性，但是它们在功能上却有很大的不同。IKKα-/-小鼠在出生后4小时就由于多种形态缺陷而死亡，尤其是表皮和骨骼的发育存在明显缺陷。与IKKβ-/-小鼠不同，IKKα-/-小鼠中没有发现肝细胞的凋亡，而且在IKKα-/-小鼠的胚胎成纤维细胞、原初上皮细胞和肝细胞中，TNFα、IL-1和LPS的刺激均能诱导正常的IKK复合物的活化和IκB的降解，表明IKKα不是固有免疫和炎症反应中NF-κB活化所必需的，而可能在发育过程中有重要作用，因为新生的IKKα-/-小鼠表现出缺乏四肢、尾巴和耳朵，颅面部发育失常，皮肤光滑紧绷，上皮的形成和构造明显异常等表型。研究发现，IKKα的激酶失活突变体IKKα(AA)（IKKα的激酶区的两个丝氨酸突变为丙氨酸）能够阻断NIK诱导的p100的剪切作用；反之，过量表达持续激活的IKKα（EE）（IKKα的激酶区的两个丝氨酸突变为模拟磷酸化的谷氨酸）突变体则能促进p100的剪切。同时，IKKα-/-小鼠与p100-/-小鼠表型相似，并且在IKKα-/-细胞中，p100不能被正常剪切，而p100的剪切在IKKβ和IKKλ缺失的情况下没有明显异常。以上突变体和基因敲除实验表明，IKKα可能通过被上游蛋白激酶NIK激活的方式诱导p100蛋白的磷酸化和剪切，最终生成特定的NF-κB二聚体形式——p52:RelB，这条信号转导途径叫做NF-κB激活的非经典途径，因此IKKα主要参与NF-κB激活的非经典途径。研究发现，IKKα的上述活化方式是在某些TNF家族成员的刺激下发生的，包括B细胞激活因子 （Bcell-activating factor，简称BAFF），淋巴毒素β（LTβ）以及CD40的配体等。但在某些情况下IKKα也会参与经典的NF-αB激活途径。此外，IKKα还与角质细胞的分化有关，但此功能是不依赖其激酶活性的，而且与NF-κB激活无关，但有研究表示可能与其NLS有关。

IKKα-/-IKKβ-/双敲除小鼠在NF-κB信号通路中有更多的缺陷，发育过程中无法形成神经胚，IKKα-/-IKKβ-小鼠的胚胎成纤维细胞对于TNFα、IL-1和LPS的刺激不应答，但神经胚的缺失在IKKλ-/-小鼠中没有出现。

同IKKβ一样，NF-κB活化的经典信号途径也需要IKKλ。IKKλ负责将IKK复合物的催化亚基与上游信号通路联系起来，它通过C端与上游的接头蛋白作用激活IKK，而N端与IKKα、IKKλ结合。但在IKKα依赖的非经典信号途径中不需要IKKλ。IKKλ的功能失活（loss-of-function）和基因敲除实验都表明，IKKλ是NF-κB激活的经典信号途径中IKK激酶复合物活化所必需的。IKKλ-/-小鼠在E12.5-E13天由于大量的肝细胞凋亡而死，用TNFα、IL-1和LPS等处理IKKλ-/-小鼠的胚胎成纤维细胞，IKK激酶复合物和NF-κB均不能被活化，

NF-κB的激活完全阻断。IKKλ可能将两个IKKα/β二聚体在空间距离上拉近，从而使它们通过transautophosphorylation作用互相活化来介导信号通路。

3 NF-κB活化的信号途径

如前所述，NF-κB激活的信号途径主要分为经典信号途径（classicalpathway或canonicalpathway）和非经典信号途径 （alternativepathway或noncanonicalpathway）(Senftlebenetal.,2001)。除此之外，研究表明还存在其它的NF-κB活化信号途径。

3.1 NF-κB激活的经典信号途径

在病原微生物感染或其诱导的炎症因子的刺激下，NF-κB通常依赖经典信号途径被活化。简言之就是NF-κB二聚体，如p50:RelA，通过与抑制性IκB蛋白（通常是IκBα）结合而被滞留在细胞质中；某些配体与细胞表面受体（如TNF受体或Toll样受体等）的结合招募下游接头蛋白（如TRAF家族蛋白或RIP等），继而招募IKK复合物 （包括IKKα、IKKβ催化亚基和IKKλ调节亚基），并导致IKK复合物的活化；IKK复合物，尤其是IKKβ亚基磷酸化IκB蛋白的两个丝氨酸残基，导致IκB蛋白的泛素化和蛋白酶体依赖的降解，并释放NF-κB进入细胞核，激活下游基因转录。经典途径被认为是大多数NF-κB激活的主要模式，但不是唯一模式。经典途径激活主要诱导产生黏附分子VCAM-1、ICAM-1、E-selectin，炎症趋化因子IL-8、RANTES、MCP-1，细胞因子IL-6、TNFα、IL-1β等，因此对于炎症反应和固有免疫应答很重要。TNF信号通路的特征是它既可以诱导细胞的凋亡又可以促使细胞存活，这两条通路的平衡导致细胞的活化。如果激活NF-κB的信号通路活化，结果就是使细胞存活，但如果NF-κB的活化被阻遏，TNF就变成一个有力的细胞凋亡诱导因子。TNF信号通路的两个靶转录因子，NF-κB和AP-1，也直接参与凋亡或存活的选择，长时间的JNK/AP-1的激活导致凋亡，而NF-κB可诱导合成一些效应物来阻断JNK/AP-1信号通路，因此限制JNK/AP-1的激活，如GADD45β，通过阻断上游的激酶MKK7抑制JNK/AP-1信号通路。但JNK和NF-κB的作用也不是完全对立的，如抗凋亡蛋白cIAP1就是JNK和NF-κB共同调节的。

研究表明，很多NF-κB信号途径的负调节分子通过抑制TIR受体家族诱导的信号通路来发挥作用，如SIGIRR（singleimmunoglobulinIL-1Rrelatedmolecule）、ST2、IRAK-M、MyD88s（splicing variantof MyD88）等。SIGIRR是TIR受体家族的一种孤受体（orphan receptor），可能通过与受体、IRAK和TRAF6等蛋白形成复合体从而竞争性地抑制TIR信号通路；ST2也属于TIR受体家族中的孤受体，ST2缺失小鼠的巨噬细胞在IL-1或LPS刺激时均比野生型细胞产生了更多的促炎细胞因子，有实验证明ST2可以在LPS等刺激下诱导产生，并抑制MyD88依赖的TLR/IL-1R激活NF-κB的信号通路；IRAK-M是IRAK家族成员之一，它只在单核细胞和巨噬细胞中表达，并且在细胞受到TLR/IL-1R的配体刺激时表达量有所增加，它可能通过干扰IRAK1的功能，阻碍IRAK1与TRAF6之间的相互作用来行使负调控功能的。MyD88s是MyD88的一种剪切形式，缺失了DD和TIR结构域之间很短的一段序列。MyD88s在单核细胞中受LPS的诱导时表达量上调，但是它不能与IRAK4结合，因此它通过竞争性地阻止IRAK4被招募到受体复合物上，从而成为TIR受体家族介导的NF-κB活化信号途径的负反馈调节因子。

NF-κB激活的非经典信号途径。B细胞和T细胞器官发育过程中，某些胞外信号 （如LTβ、BAFF或CD40L等）的刺激会诱导NF-κB非经典信号途径的激活。该途径主要通过激活信号分子NIK激酶，继而磷酸化含有两个IKKα亚基的复合体；IKKα复合体通过磷酸化p100导致其被剪切，从而促成p52:RelB二聚体的形成，激活特定基因转录。p52:RelB是细胞中存在的一种NF-αB异源二聚体形式，当p52的前体分子p100与RelB结合时，二聚体处于非活性状态，当p100被剪切产生p52时形成有活性的p52:RelB。NF-κB激活的非经典途径是不依赖IKKβ和IKKλ的，它是由TNFR家族的部分成员，如B细胞上的BAFF-R和CD40以及脾基质细胞上的LTβR等介导的(Bonizzi et al.,2004)。非经典信号途径的激活对于次级淋巴器官的发育和维持及适应性免疫应答很重要。

3.2 NF-κB激活的其他信号途径

除了上述经典途径和非经典途径之外，NF-κB的激活也可以由IKK非依赖性的信号途径介导。比如，紫外线（UV）辐射等刺激诱导的NF-κB的活化似乎就不需要IKK复合物的参与，而是p50（或

p52）同源二聚体与共激活因子Bcl-3等相互作用，从而具有转录激活活性。

4 NF-κB信号通路的调节机制

细胞内NF-κB的活性是受到严格的调控的，因为一旦NF-κB活化失控，就会破坏机体的平衡，导致包括各种癌症、神经退行性疾病、毛细血管扩张失调症、慢性炎症及各种自身免疫疾病等多种疾病的发生。因此，研究NF-κB的活性调节机制不仅对研究细胞信号转导的基础理论有重要意义，而且也为相关疾病的治疗及药物研发提供了新的途径和靶标。

许多激活NF-κB的信号通路在IKK水平上交汇，因此它是NF-κB调节机制的关键。IKK活化的模式可能是：在静息状态时，IKKα和 IKKβ与NEMO结合，掩蔽了IKK的激酶区，因此阻碍了IKK的活化。NEMO与接头蛋白RIP等的结合或NEMO的泛素化修饰导致NEMO的寡聚化，从而使IKK复合体的构象发生改变，使IKK的激酶区暴露出来，接着激酶区内的活化环结构中两个保守的Ser残基通过transautophosphorylation或IKK激酶如TAK1等被磷酸化修饰，导致IKK的活化。活化的IKK接着使下游的底物磷酸化，包括IκB、IKK的NBD的Ser740和IKK的C端HLH结构域中的多个Ser位点和NEMO的Ser68等。NEMO的磷酸化使NEMO从IKK复合体上解离下来，接着分子伴侣Hsp-90/Cdc37和蛋白磷酸化酶 PP2A（protein phosphatase2A）或PP2Cβ使IKK复合体重新装备成无活性的形式。

IKK复合物的活化是依赖于磷酸化修饰的，IKK复合物在用蛋白磷酸化酶PP2A或PP2Cβ处理时失去激酶活性，而用PP2A的抑制剂okadaic acid处理时又能恢复IKK的活性。像其它蛋白激酶一样，IKKα和IKKβ的激酶结构域中都包含一个活化环（activation loop）结构，IKK激酶复合物受到上游信号刺激后，活化环结构中两个保守的Ser残基被磷酸化修饰，导致IKK的激活。IKKα主要依赖活化环结构中的Ser177和Ser181两个位点被磷酸化而获得激酶活性，活化的IKKβ还可以通过自身磷酸化使C端HLH结构域中的多个Ser位点进一步磷酸化。如果将IKKβ中的Ser177和Ser181都替换成丙氨酸，即将IKKβ(SS)替换成IKKβ(AA)，就会阻断IKKβ的活化；反之，如果将它们替换成模拟磷酸化的谷氨酸，即IKKβ(EE)，则会导致IKKβ的持续活化。同样的，IKKα蛋白的活化环结构中相应位置的Ser176和Ser180在细胞受到刺激时也有类似的修饰和功能。IKKβ的C端Ser富集区的缺失突变体在TNFα刺激下正常激活，但活化的持续时间增长，说明IKKβ的C端HLH结构域中Ser富集区的自身的磷酸化是一个负调节机制。

活化IKK复合物的激酶叫做IKK-K，很多上游的激酶被认为是IKK-K，但在基因敲除实验中大多数都缺乏证据，这更说明IKK可能主要是通过自身的磷酸化来调节的，而更多的IKK-K可能是接头蛋白而非激酶。IKK的自身的磷酸化可能是由于受到上游信号刺激后使得IKKα-IKKβ之间的空间距离接近或构象改变从而导致互相活化，这可以由IKK的多聚化或多种接头蛋白如RIP、TRAF募集IKK来介导。研究表明参与NF-κB活化经典信号途径的IKK-K可能主要是TAK1，而参与非经典信号通路的是NIK。TAK1在TNFα或IL-1等刺激下可以被激活，并且活化的TAK1存在于IKK激酶复合物中。NIK则是通过直接磷酸化并活化IKKα的方式，激活由LTβR和BAFF-R等诱导的NF-κB活化的非经典信号途径[14]。

因为IKK的激活与很多接头蛋白有关，如RIP、TRAF等，所以也可以通过这些接头蛋白间接的调节IKK的激活。如前所述，泛素化的修饰在此类调节中发挥了很重要的作用，研究表明，通过泛素分子第48位赖氨酸（K48）连接的多聚泛素链的修饰通常与蛋白降解有关，而K63位连接的泛素化修饰通常与蛋白功能的调节有关。TRAF家族蛋白可以作为E3泛素连接酶将自身和IKKλ以K63位连接的方式泛素化，并通过共价连接的多聚泛素链与TAB2-TAB3-TAK1复合体相互作用，从而使TAK1活化激活 IKK复合物。而去泛素化酶DUB通过去除RIP、TRAF以及IKKλ等蛋白的K63位泛素化而起到负调节的作用，如A20和CYLD。A20依赖其N端去泛素化酶结构域OTU去除RIP蛋白的K63位连接的多聚泛素链，从而抑制RIP的功能；再借助其C端锌指结构域的泛素连接酶功能使RIP被K48位连接的泛素化修饰，从而使RIP被蛋白酶体降解。因此A20是通过去除RIP蛋白的K63位功能调节型泛素化和诱导K48位降解型泛素化修饰的

双重作用来进行负调控的。CYLD依赖其C端的一个在Dubs家族中广泛存在的UBP结构域发挥去泛素化作用，它通过与TRAF2和IKKα分别相互作用，特异地去除它们的K63位连接的泛素链，从而阻断IKK复合物的活化。

另外，还有一些蛋白通过与IKK结合来调节IKK的激活，如Hsp-90/Cdc37和ELKS。Hsp90可能在IKK激酶复合物中充当分子伴侣的作用，促进激酶蛋白的正确折叠，Hsp-90/Cdc37的抑制者GA，抑制了TNFα刺激下的IKK的激活，它也可以和NF-κB信号通路中的多种激酶作用，如RIP、NIK、TBK1等，有研究表明，Hsp-90/Cdc37可能和IKKα结合从而调节IKKα的寡聚状态。ELKS是通过免疫亲和纯化的方法筛选出来的与IKKα相互作用的蛋白，它的结构与IKKα相似也含有CC结构域和LZ结构域。在未受刺激的细胞中，ELKS是IKK复合物的化学组分之一。RNAi介导的ELKS表达量的降低抑制了IKK的激活以及TNFα和IL-1诱导的前期NF-κB的激活，但是对NF-κB后期激活没有显著影响。另外，在免疫共沉淀实验中ELKS与IκBα能够相互结合，而降低ELKS的表达量则破坏了IKK复合物与IκBα的结合，表明ELKS可能招募IκBα到IκBα复合物中IKK。

NF-κB的活化还可以通过IκB蛋白来调节，主要涉及IκBα。我们都知道IκB蛋白的降解释放了NF-κB二聚体，使其可以入核激活相应基因的转录。IκBα也是NF-κB转录激活的靶基因之一，NF-κB的活化导致IκBα的表达，产生的IκBα蛋白进入细胞核内与活化的NF-κB结合，由于NF-κB与IκBα的亲和力大于其与DNA结合的亲和力，于是NF-κB和IκBα复合体从DNA上解离下来，并通过IκBα分子上的核输出信号 （nuclearexportsignal，简称NES）将NF-κB带回细胞质中，从而中止NF-κB的活化。因此，NF-κB的活化一方面启动很多效应基因的转录，另一方面生成IκBα蛋白负反馈调节NF-κB的活性，中止NF-κB活化信号，从而控制NF-κB的应答的强度和持续时间[16]。除了诱导产生IκBα对NF-κB的转录激活进行调节外，还有很多方式影响NF-IκB的转录激活活性，如NF-κB家族蛋白的翻译后的修饰、与一些转录共因子作用等。NF-κB家族蛋白的翻译后的修饰涉及磷酸化修饰及乙酰化修饰，以p65为例，蛋白激酶A（PKA）可以使p65的Ser276磷酸化，此磷酸化有两个作用，一是可以增强p65与DNA的结合能力；一是为转录共激活因子CBP/p300提供一个作用位点，未磷酸化的p65，C端与Rel区相互作用，因此阻碍了p65与DNA及CBP/p300的结合，Ser276位的磷酸化阻止了这种分子内的C端与N端的作用，因此增强了NF-κB的转录激活活性；此外IKK也可以通过对p65的Ser536位磷酸化来增强NF-κB的转录激活活性。研究表明p65共有4个磷酸化位点，2个在Rel同源区（Ser276、Ser311），2个在TAD区，转录的激活可能需要每组中至少一个位点磷酸化。而p65的乙酰化涉及多个位点，其中K218、K221的乙酰化增强转录激活活性，可能是通过减弱与核内IκBα的结合的方式来作用，而K122、K123的乙酰化则抑制转录激活活性，可能是降低了与DNA的亲和力。NF-κB还可以与一些转录共因子作用，如C/EBP，AP-1，Sp-1，SRF，STAT6等，来调节其转录激活[17]。

5 小结与展望

总之，NF-κB信号通路对于机体的固有免疫和炎症反应以及适应性免疫等生理病理过程是非常关键的，因此NF-κB信号通路的失控会导致许多人类疾病，尤其是与慢性炎症、免疫缺陷以及癌症相关的疾病，如哮喘、动脉粥样硬化、炎性肠炎，AIDS、类风湿性关节炎、癌症等。研究表明，许多类型的癌症中都存在NF-κB的组成型激活。因此，对转录因子NF-κB活化机制的研究，不仅对于探讨细胞信号转导的基础理论有重要的意义，而且也为某些疾病的治疗及药物开发奠定了理论基础，提供了新的途径和靶标。近年来的研究已极大的完善和补充了NF-κB信号通路，但仍有许多问题等待解决，如对于不同的NF-κB二聚体的调节、泛素化修饰的确切的调节功能、以及细胞应激引起的NF-κB的活化的具体机制等等，都需要更深入的研究。

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TN911.6

甘肃省自然科学基金项目（NO.1107RJZA141）；兰州市社会发展项目（NO.2013-3-72）

△ 通讯作者：朱嘉宁，硕士。研究方向：动物保护生物学，Email:bluedreame@163.com。