两种茯苓固体发酵菌质的制备及其主要成分含量测定*

余梦瑶，魏 巍，许晓燕，江 南，罗 霞

（四川省中医药科学院中药细胞与分子生物学实验室，四川 成都 610041）

两种茯苓固体发酵菌质的制备及其主要成分含量测定*

余梦瑶，魏 巍，许晓燕，江 南，罗 霞**

（四川省中医药科学院中药细胞与分子生物学实验室，四川 成都 610041）

采用固体发酵技术，得到两种茯苓固体发酵菌质。以茯苓（Poria coco） 为发酵菌株，分别以山药（Dioscorea opposita）和面粉为培养基进行发酵，分别在茯苓菌丝满瓶后40 d、50 d、60 d、70 d、80 d时取样，测定样品中茯苓酸、尿囊素、浸出物和水分的含量。结果表明，以山药为基质发酵茯苓，基质含水量50%，转化温度25℃，转化时间为茯苓菌丝满瓶后60 d，可以制备良好的茯苓－山药固体发酵菌质；以面粉为基质发酵茯苓，基质含水量40%，转化温度25℃，转化时间为菌丝满袋后60 d，可制成良好的茯苓－面粉固体发酵菌质。

茯苓；山药；面粉；固体发酵

茯苓 [Poria cocos(Schw.)Wolf]是应用较多的食（药）用菌，为多孔菌科（Polyporaceae）卧孔菌属（Poria）真菌茯苓的干燥菌核[1]。在茯苓中茯苓多糖为主要成分，具有提高机体免疫、抗肿瘤、抗衰老、抗炎等作用[2]，在医学上有广泛的应用。

固体发酵（solid state fermentation）指体系在没有或几乎没有自由水存在下，微生物在固态物质上生长的过程。该过程中维持微生物活性需要的水主要为结合水或与固体基质结合的状态[3]。其中中药材固体发酵是现代生物技术和中药学的完美结合，利用微生物强大的分解转化物质的能力，保护中药活性成分免遭破坏，提高中药药效和活性成分的含量，节省药源，减毒增效，并为中药活性成分结构修饰提供了新途径。陈丽艳等[4]用猴头菌发酵刺五加增强了抗疲劳作用。许晓燕等[5]用灵芝与丹参双向固体发酵形成药性菌质，治疗血瘀模型小鼠效果显著。谷坤睿等[6]探索甘草渣和14种不同的灵芝菌株的复合型双向发酵，结果表明，经过真菌与中药材双向发酵后的菌质药效成分含量有不同程度的提高，是一种可行的中药材制备技术。而利用茯苓菌发酵山药和面粉的研究尚未见报道。本文采用茯苓山药发酵和茯苓面粉发酵的新方法得到2种茯苓固体发酵菌质，现把结果报道如下。

1 材料

1.1 发酵菌株

茯苓菌株，由四川省中医药科学院中药细胞与分子生物学实验室提供。

1.2 发酵基质

面粉（小麦粉）购买于红旗超市，出自益海嘉里集团；山药为药用淮山药，购于药店。

1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氢钾1.5 g、硫酸镁0.5 g、琼脂15 g，蒸馏水补足1 L，pH自然。

1.4 主要试剂

乙腈为色谱纯；其余试剂均为国产分析纯。

1.5 仪器设备

KXH-101-2A型热鼓风干燥箱，YX-400A型灭菌锅，ZGX-300C型智能光照培养箱，W-201B型恒温水浴锅，LDZ5-2型低速自动平衡离心机，LDZ5-2型高速离心机，UV-2802型紫外可见分光光度计，Watersl525/2487高效液相。

2 方法

2.1 菌株活化

取茯苓菌种，按照无菌操作要求，转接小菌块在PDA斜面培养基上，于25℃培养6 d～7 d，待菌丝长满后备用。

2.2 茯苓固体发酵菌质的制备

2.2.1 茯苓－面粉固体发酵菌质的制备

将活化好的茯苓菌种接种到制备好的培养基[7]上，其中基质含水量为40%。置于25℃恒温培养箱中避光培养。分别在菌丝满瓶后40 d、50 d、60 d、70 d、80 d时取样进行成分含量分析。取样时将样品菌质烘干粉碎备用，每个样品做3个重复。面粉的处理按照参考文献 [7]。

2.2.2 茯苓－山药固体发酵菌质的制备

培养基配制：每500毫升组织培养瓶中瓶装入100 g山药，加100 mL蒸馏水浸泡2 h，灭菌冷却。将活化好的茯苓菌种接种到制备好的培养基上，置于25℃恒温培养箱中避光培养。分别在菌丝满瓶后40 d、50 d、60 d、70 d、80 d时取样进行成分含量分析。取样时将样品菌质烘干粉碎备用，每个样品做3个重复。

2.3 茯苓酸测定

2.3.1 样品制备

取样品0.5 g，加入甲醇20 mL，超声提取30 min，取滤液，干燥，加入1 mL甲醇溶解，供HPCL测定使用。

2.3.2 色谱条件

色谱柱 C18（Thermo， HYPERSil BDS，150 mm×4.6 mm）；流动相A为乙腈，流动相B为0.2%磷酸溶液（φ）；按下表1条件梯度洗脱；流速1 mL·min-1；柱温30℃；进样量20 μL；检测波长210 nm。

表1 梯度洗脱流动相比例Tab.1 Proportion of mobile phase of gradient elution

2.3.3 标准曲线的绘制及样品的检测

分别配制茯苓酸标准溶液0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1，按2.3.2的方法测定。

以茯苓酸的含量为x轴，以HPLC测得的峰面积为y轴做标准曲线。将样品供试液测定后，按标准曲线查得相应茯苓酸含量。

2.4 尿囊素测定

2.4.1 样品制备

取样品0.5 g，加入甲醇20 mL，超声提取30 min，取滤液，干燥，加入1 mL甲醇溶解，供HPCL测定使用。

2.4.2 色谱条件

色谱柱 NH2-C18（Thermo， HYPERSil SPS-2，150 mm×4.6 mm）；流动相为90%乙腈；流速1 mL·min-1，柱温30℃；进样量20 μL，检测波长205 nm。

2.4.3 标准曲线的绘制及样品的检测

分别配制尿囊素标准溶液0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1和0.5 mg·mL-1，按2.4.2的方法测定。以尿囊素的含量为x轴，以HPLC测得的峰面积为y轴做标准曲线。将样品供试液测定后，按标准曲线查得相应尿囊素含量。

2.5 浸出物测定

参照《中国药典》2005年版附录ⅢA下的热浸法测定[8]。

2.6 含水量测定

参照《中国药典》2005年版附录ⅨH第一法测定[9]。

3 结果与分析

3.1 苓酸含量

茯苓－面粉、茯苓－山药发酵菌质的茯苓酸含量变化见图1。

图1 茯苓－面粉、茯苓－山药发酵菌质中茯苓酸的含量变化Fig.1 Content variation of pachymic acid in Poria cocos with wheat flour fungal substance and P.cocos with Dioscorea opposite fungal substance

由图1可以看出，在茯苓菌丝满瓶后40 d～60 d内茯苓－面粉、茯苓－山药菌质中茯苓酸含量逐渐升高；60 d以后茯苓－山药菌质中茯苓酸含量开始下降。茯苓酸是茯苓的主要活性成分，较高的茯苓酸含量可以作为2种新型菌质产品开发的保证。因此在茯苓菌丝满瓶后60 d采收发酵菌质是合适的，此时菌质中茯苓酸的含量最高。

3.2 尿囊素含量

茯苓－山药菌质中尿囊素的含量变化见图2。

图2 茯苓－山药菌质中尿囊素的含量变化Fig.2 Content variation of allantoin in Poria cocos with Dioscorea opposite fungal substance

由图2可以看出，在茯苓菌丝满瓶后，茯苓－山药菌质中尿囊素含量先逐渐减低再略有升高达到平衡，60 d以后尿囊素含量保持稳定。尿囊素是山药中的主要药性成分，尿囊素的降低可能是山药与茯苓双向发酵过程中物质相互转化的结果。60 d以后尿囊素含量保持不变，可能是菌质中药效成分相互转化达到平衡的结果。尿囊素是山药的标志性成分，所以茯苓-面粉发酵菌质中没有测定其含量。

3.3 浸出物含量

茯苓－面粉、茯苓－山药发酵菌质中浸出物的含量变化见图3。

图3 茯苓－面粉、茯苓－山药发酵菌质中浸出物的含量变化Fig.3 Content variation of extract in Poria cocos with wheat flour fungal substance and P.cocos with Dioscorea opposite fungal substance

由图3可以看出，在茯苓菌丝满瓶后茯苓－面粉、茯苓－山药菌质中浸出物含量变化不大；在发酵60 d时茯苓－面粉菌质中的浸出物含量最大；在发酵80 d时茯苓－山药菌质中浸出物的含量最大。

3.4 水分含量

茯苓－面粉、茯苓－山药发酵菌质含水量的变化见表2。

表2 茯苓－面粉与茯苓－山药发酵菌质中含水量的变化Tab.2 Substrate moisture variation of Poria cocos with wheat flour fungal substance and P.cocos with Dioscorea opposite fungal substance

由表2可知，在茯苓菌丝满瓶后茯苓－面粉、茯苓－山药菌质中的含水量基本保持稳定。茯苓-山药菌质中，含水量在11%左右；茯苓-面粉菌质中，含水量在15%左右。面粉在发酵过程中更容易保持水分。

4 讨论

中药发酵是中药学与微生物学两门学科的重要结合点之一。山药或面粉不仅作为药性基质提供茯苓菌生长的营养物质，而且茯苓菌在生长代谢过程中产生的酶，会与基质中的山药或面粉发生生物化学反应，使山药或面粉中原有物质被修饰或分解，从而产生底物衍生物或新的成分；同时产生的菌质是真菌菌丝体利用山药或面粉基质构造专性产物，生物转化作用改变山药或面粉单一基质的药效，产生生物级联放大效应。其中，山药经茯苓菌转化后使一些大分子转化为多种活性小分子，更利于吸收，且提高药效[10]。

本文通过茯苓酸、尿囊素、浸出物、含水量4项质控指标，建立了茯苓－山药、茯苓－面粉固体发酵菌质的制备方法：以山药为基质，基质含水量50%，转化温度25℃，转化时间为茯苓菌丝满袋后60 d，茯苓酸含量最高，尿囊素、浸出物和水分保持相对稳定，可以制备良好的茯苓－山药固体发酵菌质。以面粉为基质，基质含水量40%，转化温度25℃，转化时间为菌丝满袋后60 d，茯苓酸含量最高，尿囊素、浸出物和水分保持相对稳定，可以制备良好的茯苓－面粉固体发酵菌质。

本试验采用PDA培养基培养固体茯苓菌种，菌体长势良好，菌丝浓密洁白分布均匀。固体发酵条件成熟，菌体生长及产物稳定。通过HPLC法确定发酵菌质中有效物质含量，确立了一种发酵茯苓菌质的新方法。对于茯苓－面粉和茯苓－山药两种新型茯苓菌质，还需进一步提纯及结构鉴定，以确定是否有新化合物的产生。该项工作为新药开发提供了思路。通过药理学方法对比分析茯苓菌质与茯苓、山药及面粉的活性，为该菌质的应用提供依据，也是下一步的工作内容之一。

[1]张敏，高晓红，孙晓萌，等.茯苓的药理作用及研究进展[J].北大大学学报：自然科学版，2008，1（9）：63-68.

[2]李雪，罗秀萍，梁宏东，等.茯苓多糖的研究进展[J].畜牧与饲料科学，2015（4）：45-46，53.

[3]庄毅，洪净.药用真菌双向性固体发酵工程与中成药药渣再开发[J].中国中药杂志，2006（22）：1918-1919.

[4]陈丽艳，金爽，张迎，等.猴头菌发酵炮制中药刺五加对

[5]许晓燕，郑林用，李艳，等.灵丹菌质双向发酵工艺及药效品质研究[J].中国食用菌，2010，29（2）：28-31.

[6]谷珅睿，秦俊哲，陈合.14个灵芝菌株的新型（双向型）固体发酵及菌质多糖含量测定[J].时珍国医国药，2005，4（16）：313-314.

[7]罗霞，魏巍，余梦瑶，等.培养食药用菌的固体发酵基质及其制备方法和用途[P].

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录56.

[9]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录47.

[10]陈丽艳，张迎，金爽，等.黄芩经侧耳菌和黑曲霉发酵后黄酮类成分的变化[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（5）：63.

Preparation and Main Component Content of Two Novel Poria cocos Fungal Substances by Solid-Fermented Technique

YU Meng-yao,WEI Wei,XU Xiao-yan,JIANG Nan,LUO Xia
(Cellular and Molecular Lab of Chinese Materia Medica,Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences,Chengdu 610041, China)

Two novel Poria cocos fungal substances by solid state fermentation (SSF)were produced.P.cocos was fermented in Dioscorea opposite and wheat flour respectively.The fungal substance was harvested at 40 d,50 d,60 d,70 d,80 d after mycelia overgrown the bottle.The contents of water,extract,allantoin,pachymic acid were determined.The results showed that P.cocos with D.opposite fungal substance was got with 50%substrate moisture in 25℃at 60 d after mycelia overgrown the bottle,and the P.cocos with wheat flour fungal substance was got with 40%substrate moisture in 25℃at 60d after mycelia overgrown the bottle.

Poria cocos;Dioscorea opposita;wheat flour;solid state fermentation

S646.9

A

1003-8310（2016）02-0050-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2016.02.013

四川省杰出青年学术技术带头人资助计划（2014JQ0024）；四川省科技厅条件平台建设项目（A－2014N－37）；四川省精深加工研究岗位建设项目（川农业（2009） 75号）；四川省农业微生物资源共享平台建设（15010302）；科研院所成果转化资金项目（14010156）；以精深加工为核心的食药用菌产业关键技术集成与产业化（成财教〔2013〕265）;四川省科技基础条件平台建设项（A－2014N－38）。

余梦瑶（1981－），男，博士，副研究员，主要从事菌类药材方面研究。E－mail:50086283@qq.com

**通信作者：罗霞（1974－），女，博士，研究员，主要从事菌类药材方面研究。E－mail:287748567@qq.com

2016－01－15