金黄色葡萄球菌Sortase A原核表达纯化方法的研究进展

胡义芳，杨朝博，秦松，柳长柏，邹黎黎，王君

(1.三峡大学人民医院细胞治疗研究所，湖北 宜昌 443003；2.三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002；3.三峡大学人民医院转化神经科学&神经再生修复实验室，湖北 宜昌 443002)

·综 述·

金黄色葡萄球菌Sortase A原核表达纯化方法的研究进展

胡义芳1，2，杨朝博1，2，秦松1，2，柳长柏1，2，邹黎黎1，2，王君1，3

(1.三峡大学人民医院细胞治疗研究所，湖北 宜昌 443003；2.三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002；3.三峡大学人民医院转化神经科学&神经再生修复实验室，湖北 宜昌 443002)

众所周知，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)转肽酶A(Sortase A)在致病中起着不可或缺的作用，已成为重要研究的靶酶。虽然已有多种实验方法用于Sortase A的原核表达纯化，但由于缺乏通用的技术来得到理想的目的蛋白，因此应当结合使用多种方法以降低误差。对不同的技术在金黄色葡萄球菌Sortase A原核表达过程的优缺点进行比较分析，并针对性地提出比较理想的解决方案，可为Sortase A作为靶酶的研究提供一些参考。

金黄色葡萄球菌；转肽酶A；原核表达；纯化

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一种革兰氏染色阳性、凝固酶阴性的葡萄球菌[1]。其作为一种主要的人畜共患病病原体，易引起皮肤软组织感染、败血症、心内膜炎、肺炎、肠炎、脑膜炎、骨髓炎及中毒性休克综合征等细菌感染性疾病[2-3]。近年来的流行病学调查研究显示，以SA为代表的凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negative staphylococci，CoNS)已成为医院获得性感染的一种具有重要临床意义的主要病原菌[4]。这主要是由于SA对环境的适应性很强且其基因组具有高度多态性和可变性，极易产生对抗生素的耐药性导致的[5]。鉴于近年SA耐药菌株的产生日益增多，甚至出现了多重耐药，使得临床工作中可供选择的药物越来越少，急切需要从基因水平去分析这种耐药现象并找寻新的抗菌靶点，以针对性的治疗SA引起的严重感染。转肽酶A(Sortase A)最初由Mazmanian等[6]于1999年在金黄色葡萄球菌中发现，是一种广泛存在于革兰氏阳性菌中的保守的管家基因(Housekeeping gene)[7]。它是一种膜结合转肽酶，将特定的表面蛋白毒性因子锚定到细胞壁肽聚糖上，帮助病原菌逃逸宿主免疫系统的监视[8-9]。可见Sortase A在SA等革兰氏阳性菌致病过程中发挥着关键性作用。目前，已有大量研究表明，Sortase A是一种重要的毒力因子，在其感染过程中发挥重要作用，如，Gianfaldoni等[10]研究发现，肺炎链球菌重组Sortase A蛋白免疫小鼠后能抗肺炎链球菌感染；Sortase A缺失，病原菌的致病性将会显著减弱等[11]。祝令伟等[12]研究发现，猪链球菌2型分选酶srtC5基因敲除突变株的细胞粘附能力和对家兔的致病性都显著降低；王亚男等[13]通过研究探讨发现芦丁可能成为Sortase A的潜在抑制剂。因此，Sortase A有望成为新的抗菌靶酶，为日益严重的病原菌耐药性问题提供思路。本文对不同的技术在金黄色葡萄球菌Sortase A原核表达过程的优缺点进行比较分析，并针对性地提出比较理想的Sortase A的原核表达纯化方法，为转肽酶抑制剂筛选相关的酶学性质的研究提供帮助，同时为相关疫苗的发现提供一些参考。

1 转肽酶的生物学特性

1.1 转肽酶的分类 在GeneBank中查询可知，转肽酶A几乎存在于所有的革兰氏阳性菌中，如肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌、猪链球菌等，且在不同病原菌中其基因数量不同，功能也有差异。Comfort等[14]对72种转肽酶相关基因组序列进行比对，将其分为5个亚科：SrtA、SrtB、3、4、5，发现前两种与SA转肽酶高度同源。后来又有学者Dramsi对61个转肽酶进行分析，建议分为4类，即SrtA、SrtB、SrtC、SrtD，且发现Sortase A为保守的管家基因[15]。目前转肽酶的分类法是Dramsi分类法。

1.2 Sortase A的结构及功能 Sortase A包含一个N末端信号肽和一个C末端信号肽。C末端又称为细胞壁分选信号(Cell wall sorting signal，CWSS)[16]，由保守氨基酸序列(LPXTG结构域)、一个疏水区域和尾部带电荷的氨基酸残基组成。Sortase A为Ⅱ型跨膜拓扑结构，N末端在细胞内，C末端在细胞外[17]。Sortase A的主要作用是将病原菌的表面蛋白锚定到细胞壁上，使病原菌逃逸宿主免疫系统的监视，为SA的感染提供条件。首先Sortase A帮助表面蛋白前体在信号肽存在条件下进入分泌系统，使疏水区和带电残基固定膜，然后Sortase A通过反应切断LPXTG序列中的苏氨酸与甘氨酸间的肽键，最后将苏氨酸残基连到细胞壁上[18]。鉴于SortaseA在革兰氏阳性菌中功能的保守性及重要性，将其作为革兰氏阳性菌抗感染的靶酶，为抗生素耐药问题提供突破口。

2 金葡菌Sortase A基因的几种原核表达纯化体系研究进展

众所周知，蛋白的原核表达形式大致有3种：(1)胞外分泌表达，容易纯化且不容易被分解，但一般只有少量的蛋白质分泌到胞外；(2)周质空间表达，有利于蛋白的正确折叠和二硫键的形成；(3)胞内表达，即包涵体表达，需要变性复性等复杂过程。为了进一步了解Sortase A的免疫原性、功能及作用特点，得到纯度高且活性好的Sortase A蛋白，找到适合目的基因表达的原核表达载体至关重要。下面就几种原核表达载体表达的Sortase A相关蛋白的难易程度及纯度活性作分析比较，找出各表达体系的优势所在，得到理想的SASortaseA原核表达纯化方法。

2.1 Sortase A在pET22b(+)和pTRX原核表达载体中的表达纯化 了解到原核表达载体pET22b(+)携带的pelB信号肽可将蛋白输送到细胞质空间，周质空间的氧化环境有利于蛋白的正确折叠及二硫键的形成[19]；而原核表达载体pTRX携带的分子伴侣硫氧还蛋白(Thioredoxin，TRX)Trx是高度可溶的多肽融合型标签，可增强目的基因在大肠杆菌中的正确折叠，加强目的蛋白的溶解性表达功能[20]。利用这两种载体的优势，罗立新等[21]用金黄色葡萄球菌Sortase A基因组全长序列分别与原核表达载体pET22b(+)及pTRX构建pET22b-srtA和pTRX-srtA原核表达序列，得到了以包涵体形式表达的pET22b-srtA目的蛋白分子量大小为45 kD，表观分子量与预期存在差异，可能与其N-末端跨膜区域有关；得到的可溶性表达的pTRX-srtA目的蛋白分子量大小为39 kD。包涵体形式表达的蛋白，表达量一般比可溶性形式的高，但包涵体蛋白需要经过变性和复性等纯化过程，不仅耗时耗力，还会导致蛋白生物活性的降低。即使pTRX-srtA是可溶性表达，但纯度和活性仍有待提高。此外，pET22b(+)和pTRX载体上没有利于目的蛋白纯化和检测的相关标签，进一步增加了纯化和检测的难度。值得注意的是，鉴于pET22b(+)和pTRX载体的局限性，不能避免目的基因Sortase A的N末端膜锚定序列对表达的影响。

2.2 Sortase A在pET32a(+)原核表达载体中的表达纯化 鉴于pET22b(+)和pTRX原核表达载体中没有利于目的蛋白纯化和检测的标签，而原核表达载体pET32a(+)包含多种融合蛋白标签，如六聚组氨酸接头His-tag、S-tag和硫氧还原蛋白接头Trx-tag，Trx-tag可增强目的蛋白的可溶性，且大多数情况下不会影响被修饰目的蛋白的免疫原性、结构和功能，6*Hi-tag有利于表达蛋白的纯化和检测。有研究表明Sortase A基因中N端Srt残基26～59不具有氨基酸保守性，表达出的StrAΔn29和StrAΔn59两种酶具有相似的生物活性[22]，所以N端切除不保守基因序列不会影响转肽酶的活性。考虑到SortaseA蛋白包涵体表达及表达量不高可能与其N-末端跨膜区域有关，所以以含有pET22b-SrtA的质粒为模板，设计合成引物，PCR扩增缺失N-末端24个和59个氨基酸的转肽酶基因StrAΔn24和StrAΔn59，避免N末端膜锚定序列对表达的影响。朱芳等[23]将构建好的pET32a-StrAΔn24和pET32a-StrAΔn59转入大肠杆菌BL21，分别在最适温度30℃和28℃及在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IsopropyI-β-D-thiogalactoside，IPTG)浓度为0.3 mmol/L条件下诱导5 h，得目的蛋白表达量分别为64.9%和64.2%；用裂解缓冲液(pH 8.0，50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，0.5%TritonX-100)重悬，超声破碎，得到绝大部分以可溶性形式存在的目的蛋白；将其超声破碎离心后的上清液上柱(His Trap HP组氨酸标记的亲和层析柱)，在结合缓冲液A(pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/LNaCl，20 mmol/L咪唑)；11%、20%和100%及洗涤缓冲液B(pH 8.0，50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑)的作用下洗脱得到分别为42 kD和37 kD的目的蛋白。经SDS-PAGE及Western免疫印迹(Western blotting)鉴别分析，得到蛋白纯度达95%。在前人的基础上不断改进和对目的基因更全面的了解和分析基础上，可知在避开目的基因N末端的膜锚定序列的同时，用原核表达载体pET32a(+)得到均以可溶性形式表达的且生物活性相似的pET32a-StrAΔn24和pET32a-StrAΔn59目的蛋白。载体pET32a(+)中His-tag使目的蛋白的纯化和检测过程更易进行，更易得到纯度更高的目的蛋白。载体pET32a(+)的表达率较高，表达量几乎达全菌蛋白的三分之二，可得到表达量高且纯度高的目的蛋白。虽然pET32a(+)载体上有相应的利于检测目的蛋白的标签，但是pET32a-StrAΔn24和pET32a-StrAΔ n59目的蛋白的纯化条件不利于蛋白生物活性的保持，对目的蛋白的活性影响比较大。因此，是否有一种原核表达体系，使其纯化出来的目的蛋白生物活性更接近于天然蛋白，这样更有利于进行SA Sortase A抑制剂的筛选。

2.3 Sortase A在pGEX-4T-1原核表达载体中的表达纯化 由于pET32a(+)载体上没有利于目的蛋白保持天然生物活性的相关标签，而pGEX-4T-1载体上含有谷胱甘肽硫转移酶(GST)标签，融合表达系统带有Tac启动子，可在IPTG诱导作用下实现高效表达；外源基因位于GST下游，不会对启动子有影响；含有GST标签可用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化，纯化条件比较温和，使融合蛋白免受胞外蛋白酶的降解，提高了稳定性；得到的目的蛋白更接近于天然蛋白，为后续的酶学实验提供了良好的基础。Sortase A的60～206氨基酸残基是其催化活性区域[22]。考虑到GST标签的优势，可构建GST-SrtAΔn59融合蛋白表达载体pGEX-SrtAΔn59，经IPTG诱导表达，以期得到纯度好活性高的融合蛋白。邓思等[24]以重组质粒pMD20-SrtA为模板，构建GST-SrtAΔn59融合蛋白，得到可溶性表达的相对分子量大小为42 kD的目的蛋白，表达量约占菌体总蛋白的40%，经亲和层析后得到其纯度为98%。对pGEX-SrtAΔn59和pET32a-StrA Δn59两种融合蛋白表达载体诱导的纯化重组蛋白活性进行粗略比较，得知pGEX-SrtAΔn59表达纯化的重组蛋白活性较高。GST标签表达的目的蛋白表达率不高，要想得到更多的目的蛋白需要增加工作量。pGEX-4T-1有GST标签，对相关的目的蛋白的纯化和检测提供方便，更容易得到纯度高的目的蛋白。纯化的条件比较温和，对目的蛋白的生物活性影响较小，可以得到更接近于天然蛋白的目的蛋白，活性更高。

综上可知，pET22b-srtA、pTRX-srtA、pET32a-StrA Δn24、pET32a-StrAΔn59以及pGEX-SrtAΔn59五种表达体系中，仅pET22b-srtA表达的目的蛋白是包涵体形式，需要经过变性、复性等复杂过程，极可能影响最终得到的目的蛋白的活性；其余四种均是以可溶性形式表达的，纯化过程相对简单，对蛋白的影响也小些；但pET22b-srtA和pTRX-srtA没有有效地避开Sortase A的N末端膜锚定序列对表达的影响，目的蛋白的表达率不高；而pET32a-StrAΔn24、pET32a-StrAΔn59和pGEX-SrtAΔn59三种体系均没有N末端膜锚定序列的影响，表达率明显得到了提高，且这三个表达体系中都有利于目的蛋白的纯化和检测的相关标签，进一步降低了纯化和检测的难度。pET32a(+)含有6*Hi-tag标签，而pGEX-4T-1载体含有的是GST标签，使pGEX-SrtAΔn59的纯化条件更加温和，得到的目的蛋白更接近于天然蛋白，活性更高。比较理想的金黄色葡萄球菌Sortase A原核表达纯化体系是pGEX-SrtAΔn59，得到了表达量高、活性好的目的蛋白GST-SrtAΔn59，给寻找SA感染的治疗新方法和新药研发奠定基础，如pGEX-SrtAΔn59已用于探索盆腔炎患者感染大肠埃希菌的新靶点及构建筛选模型中[25]。生物活性高的蛋白有利于中药抑制剂的筛选，更有利于对筛选出的潜在抑制剂进行菌体内抑制活性的评价。同时可为SrtA抑制剂的发现和它们之间构效关系的分析奠定基础。由于单一蛋白的保护效果并不理想，新一代的蛋白疫苗是预防SA感染的未来发展方向，而我们找出SA较理想的pGEX-SrtAΔn59原核表达体系可为我们提供表达量高、活性好的蛋白，可作为多种SA毒力蛋白联合免疫，以扩大其对机体的保护效应，为蛋白抗原联合疫苗提供了多种毒力作用的潜在靶标奠定基础。

3 展望

细菌耐药问题日益严重，给临床治疗带来众多不便。研究显示革兰氏阳性菌的Sortase A在病原菌致病过程中起着重要作用，是重要研究的靶酶。本文我们对SA SortaseA原核表达纯化方法进行了全面的分析，并针对性地提出比较理想的金黄色葡萄球菌Sortase A原核表达纯化方法，为Sortase A酶学研究提供一些参考。Sortase A的重组蛋白最初是以包涵体形式表达、表达量低、纯度不高且需经过变性等过程才能得到；后来经过以上对转肽酶的生物学特性以及Sortase A的几种表达载体表达的融合蛋白的各方面的分析，可知有关Sortase A目的蛋白的原核表达在表达形式、表达率、纯化难易度及生物活性等各有突破点。在以后的研究中可以根据实验情况选择相应的融合蛋白表达载体。可为今后研究转肽酶的抑制剂筛选打下良好基础；可通过抑制Sortase A相关表面蛋白的锚定机理，使病原菌更易被宿主免疫系统识别消灭，为目前的耐药性问题提供思路；也为今后制备相关疫苗奠定基础；Sortase A相关蛋白可溶性高效表达可为设计成一种促进可溶性表达标签提供思路和依据。

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Progress on the methods for prokaryotic expression and purification of Staphylococcus aureus Sortase A.

HU Yi-fang1,2,YANG Zhao-bo1,2,QIN Song1,2,LIU Chang-bai1,2,ZOU Li-li1,2,WANG Jun1,3.1.Cell Therapy Research Institute,the People's Hospital of China Three Gorges University,Yichang 443003,Hubei,CHINA;2.Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy,China Three Gorges University,Yichang 4430025,Hubei,CHINA;3.Nerve Regeneration&Transformation Laboratory,the People's Hospital of China Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei, CHINA

As is well known that Staphylococcus aureus Sortase A plays an essential role in pathogenesis and has become an important target enzyme for research.Although a large number of experimental methods have been applied for the prokaryotic expression and purification of Sortase A,there is no universal method for obtaining the ideal target protein.A variety of methods should be used in conjunction to reduce the errors.This review compares and analyzes the advantages and disadvantages of different methods for prokaryotic expression and purification of Staphylococcus aureus sortase A,and puts forward the ideal solution in order to provide some reference for the research of sortase A as the target enzyme.

Staphylococcus aureus;SortaseA;Prokaryotic expression;Purification

R378.1+1

A

1003—6350（2016）10—1640—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.031

2015-09-11)

国家自然科学基金(编号：81201766)；湖北省教育厅基金(编号：Q20151204)；三峡大学医学院2015-2016年度大学生科技创新项目(编号：2015YCX041)

王君。E-mail：wangjfox@gmail.com；邹黎黎。E-mail：zoulili@ctgu.edu.cn