耐药肺结核分枝杆菌快速诊断和治疗研究进展*

2016-03-11王燕平叶品良卢振方

光明中医 2016年5期

王燕平　叶品良　卢振方　陈　欢

王燕平1叶品良2卢振方1陈欢1

1.成都中医药大学基础医学院硕士研究生2013级(成都 610075)；2.成都中医药大学基础医学院方剂学教研室(成都 610075)

摘要：目的综述近年对耐药肺结核快速诊断及治疗的研究进展。方法查阅国内外大量文献，对耐药结核病的诊断及其中西医药治疗情况进行分析归纳。结果耐药肺结核快速诊断主要依靠分子生物学检测；耐药结核病化疗配合免疫、外科手术及中西医药结合治疗。结论分子生物学检测提高快速诊断耐药肺结核效率，但由于设备、技术、费用等因素难以普及需进一步探索；快速有效治疗方法仍在探索阶段。

关键词：耐药结核分枝杆菌；快速诊断；治疗；综述

中国是全球结核病高发国，位居世界第二[1]，以肺结核最常见[3]。目前耐药结核病发生率尤为突出。耐药结核(DR-TB)指结核病患者所排痰液中结核分枝杆菌对一种或多种抗结核药物产生耐药性；耐多药结核杆菌(MDR-TB)是指患者至少耐利福平、异烟肼两者[3,4]，耐2 种或2种以上其他抗结核药物者另列为：耐HS、RSE多少例或多少株等[5]。其快速诊断及防治是结核病疫情控制的关键。笔者就此查阅大量文献作出如下综述。

1　耐药结核杆菌快速诊断方法

约1/5的肺结核病患者可无任何症状，午后低热>1周,咳嗽、咯痰≥2周或咳血[6]等典型临床症状,结核性胸膜炎，侵犯支气管导致肺不张，代偿性肺气肿，肺实变[7]，支气管扩张明显形成毁损肺等体征则与耐药结核病患者临床表现无特异性差异。结核分枝杆菌痰培养用于确诊、耐药监测和药物敏感性试验，是诊断“金标准”，但其耗时长，不能作为快速诊断手段。

1.1快速培养仪检测系统BACTEC MGIT960快速培养系统和Bact/ALERT 3D系统均基于液体培养基，通过利用培养管中对培养基中O2和CO2浓度敏感的特殊探测器来判断是否有细菌生长。张娟等[8]通过实验对比BACTECTM MGTM960与罗氏痰培养显示自动检测系统检出敏感性与特异性优于后者，检出时间为4-16d。BacT ALERT3D培养系统，是通过定时探测特殊感应器探测板颜色变化，经自动化测算后将所得阳性菌液接种于含相应浓度抗结核药物的培养瓶，用比例法判定药敏性，该系统保证了结核菌检测标准化和质控，较传统培养基提高阳性率约10%～15%，1～2周内可报告结果，减少工作量及保证安全，但依赖特殊培养仪器，价格昂贵，限制其功能使用及普及[9]。1.2显微镜观察药物敏感性检测(microscopic observation drug susceptib ility,MODS )技术由Cavieds建立，将标本接种在24孔细胞培养板液体培养基中,加入相应抗结核药后置于特定条件下培养。MTB在培养基中生长会分泌索状因子，使其呈索状特征性结构。通过每天镜下对特征性索状结构生长的观测[10]，来确定有无MTB生长及其对药物的敏感状态。若有索状结构取之进行抗酸染色鉴定，呈抗酸杆菌即为阳性；接种40d后仍未观察到特征性结构则判定为阴性。MODS培养阳性反应结核菌在有抗结核药存在的情况下还能生长，则视为已产生耐药性。有研究表明此法的敏感性和特异性较高[11]，其检测结果与传统罗氏培养和鉴定法结果符合率为97%[12]，不依赖特殊仪器，成本低，操作安全。但检测者因长时间观察会导致视觉疲劳[13]。

1.3 基于DNA扩增(PCR)的检测方法

1.3.1巢式PCR(也称套式PCR)用内、外两套引物作两轮PCR，第二轮PCR是以第一轮PCR的产物作模板，再将扩增产物进行测序以检测其基因情况。有研究结果表明巢式PCR能准确、特异地检测耐RFP的结核分枝杆菌菌株[14]。1.3.2PCR一单链构象多态性分析(PCR—SSCP)其原理是PCR扩增产物经变性后产生两条互补单链，各单链的碱基序列不同形成不同的空间构象。其单链的空间构象因某一片段(甚至是单个碱基的变化)的碱基序列发生突变或存在多态性而变化，导致其泳动速度改变。凝胶上由不同构象DNA片段迁移率不同而显现不同带型，再与对比带型比较，即可判定待测样品是否存在突变。该法检测单碱基突变简便可靠。有研究显示该法对耐2 种以上药物的结核杆菌检出率较高[15]。本法简便快速，特异性、敏感性高，价廉，但技术要求高。

1.4基于DNA测序技术的检测方法

1.4.1DNA直接测序PCR—DNA序列测定简便、快速，但影响因素较多，只能用于确定有无基因突变而不能确定突变部位和性质，目前DNA测序已作为MTB耐药性测定的金标准。因费用昂贵，使其应用受限。故该法多作为评价其他方法的参考方法或与其他方法结合应用。1.4.2焦磷酸测序法该技术是由Nyren等于1987年发展起来的一种新型依靠生物发光进行的实时DNA测序技术。郑瑞娟等[16]运用该法检测四种耐药结核菌耐药性，结果显示该法能快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌对异烟肼、利福平、阿米卡星、氧氟沙星耐药性，是一种可对结核菌多种耐药性进行快速检测，并获得精确基因序列资料，操作简单的方法。但目前该技术适用于已知的25～30个核苷酸的短序列测序分析，对长序列测序分析有待进一步探索。

1.5基于分子杂交技术的检测方法

1.5.1限制性片段长度多态性分析(restrictionfrag-IEtantlength polymorphism，RFLP)是限制性内切酶、核酸电泳、印迹(blot)技术、探针杂交技术的综合应用。标准的结核菌RFLP分析方法学已在国际得到广泛认同并采用，使全球范围内结核分枝杆菌菌株水平鉴定的比较成为可能。

1.5.2DNA芯片检测DNA芯片检测是目前分子生物学最前沿的方法。将多种探针与待测样本的DNA或RNA进行杂交。通过检测杂交信号强度以获取样品分子的数量和序列信息。该法同时将大量探针固定于基片上，可一次检测和分析大量样品。本法快速、准确，但芯片制备复杂，检测成本高。1.5.3线性探针技术(Hain Geno-Type@MTBDRplus，简称HAIN)将标本提取结核分枝杆菌DNA扩增后直接与探针杂交，根据探针组显色情况判定是否耐药。黄玉平等[17]应用HAIN对459例涂阳肺结核患者痰标本进行快速检测耐多药肺结核研究。显示HAIN与传统药敏试验比较，二者耐药特异性、灵敏度吻合率高。耗时≤24h。但需特殊设备和环境，操作技术和防污染措施要求严格，普及应用有一定难度。1.6血清蛋白指纹图谱测定近年国内外相关学者应用蛋白质指纹图谱技术(PFT)、表面增强激光解析电离飞行时间质(SELDI-TOF-MS)技术和蛋白芯片技术进行肺结核诊断研究并初步建立了诊断模型，为蛋白质组学用于结核病的诊断提供了科学依据。方素芳等[18]应用该技术检测临床痰培养阳性包含耐药肺结核患者的血清蛋白，结果表明该方法简便、快速，标本用量少，可能成为筛选耐多药肺结核的一种新检查指标。

2　耐药结核杆菌治疗现状

2.1西医治疗

2.1.1化疗法耐药结核病化疗分为注射期、非注射期两个治疗阶段，一般耗时9～18个月，耗时长需严格遵守早期、联合、适量、规律、全程和督导原则。选药遵守至少应包括吡嗪酰胺、一种氟喹诺酮类药物(推荐高代喹诺酮)、一种注射剂(首选卡那霉素或丁胺卡那霉素)、乙硫异烟胺(或丙硫异烟胺)和环丝氨酸(如果不能应用环丝氨酸则使用对氨基水杨酸替代)原则，其中吡嗪酰胺的应用存在广泛争议，因该药耐药率已高达51%[19～22]。

除常规化疗药物外，SQ109、Quinolones、TMC-207、PA-824、OPC-67683等化疗新药近年处于临床和临床前研究。SQ109是乙胺丁醇衍生物的第2代抗菌药，能明显改善耐药结核菌活性，动物实验有与异烟肼相当的抗菌活性，耐药突变发生率低。喹诺酮类通过抑制结核菌旋转酶阻碍DNA复制，使DNA降解或死亡。TMC-207是二芳基喹啉类似物，对耐多药结核菌有相同抗菌活力，与其他抗感染药物无交叉耐药。PA-824属硝基咪唑吡喃类，用于抗结核最具代表性与异烟肼活性相当的新药，其抗菌活性仅表现在结核菌复合群，尤其针对非繁殖期结核菌或持留菌和耐药菌株，与传统抗结核药物无交叉耐药性[23]。OPC-67683是一种抑制分枝菌算合成的抑制剂，具有很强的抗结核菌包括耐药结核菌活性[24]。2.1.2介入治疗以纤支镜局部注药为主，借助纤支镜，将抗结核药物直接注射于受损肺组织局部以提高受侵袭部位抗菌药物浓度而杀菌，适用于低浓度抗结核药耐药。在此基础上发展了经胸部X线或CT定位后[25]经皮肺穿刺注药疗法及经支气管动脉介入给药等法。

2.1.3化疗结合外科手术当结核病患者出现经4～5种敏感抗结核药治疗半年至1年后仍排菌、反复感染、咯血、合并空洞内曲霉球等；或除对2～3种很弱的抗结核药外的所有抗结核药敏感性逐渐下降至耐药；或活动病灶仅局限在肺叶或一侧全肺的上述无严重呼吸系统慢性基础疾患或其他并发症等[26]可承受手术者，已越来越建议使用化疗结合手术进行治疗。

2.1.4免疫治疗患者免疫系统遭受结核菌及化疗药物破坏，免疫治疗常与化疗结合使用，我国目前常用免疫制剂为细胞因子类、分枝杆菌制剂与胸腺肽等，疗效均较为理想。近年，国内外正围绕免疫治疗及治疗指征、时机、疗程、药物选择、疗效评估等多方面深入分析，研发新型、有效的免疫制剂[27]。2.2中医及中西医治疗现状中医对肺痨主要以“杀虫”“扶正”为根本治则。杀虫常选中药为百部、海浮石、大蒜[28]、黄连；夏枯草、狼毒，猫爪草、苦参，据报道能增强感染肺结核小鼠的免疫力[29]，水车前、猫爪草、苦参有研究表明具有抑菌作用[30]；扶正注重脏腑辨证及阴阳盛衰，常分8型[31]：肺气虚、肺阴虚、肺阳虚、肺脾两虚、肺肾阴虚、肝火刑肺、心肺两虚、阴亏阳损。中医治疗特色是辨证论治，但不同医家遣药处方不同，主要包括：古方化裁、自拟方、中成药。研究报道[32，33]运用保真汤加减、八珍散、血府逐瘀汤、加味苓桂术甘汤、月华丸、百合固金汤、结核灵片、抗痨保肺丸、保肺丸、地榆稚草汤、肺痨膏、百部丸[34]、海浮石丸[35]、肺痨康[36]、结核散I+II号、复方蜈蚣散、虫草丸、金盾胶囊等，与抗结核西药联合使用疗效值得期待[37]。

3　结语

耐药结核病疫情给抗痨工作带来新挑战，其耐药机制、诊断、防治等目前尚未取得重大突破。耐药型致病并无特异性临床表现，但给患者、医疗事业、传染病防治等带来极大威胁，故对其能快速诊断，及时有效防治尤为重要。目前传统痰培养仍是诊断“金标准”，但耗时长。分子生物科学技术的崛起为快速诊断耐药结核病提供研究方向，其中巢式PCR、PCR—SSCP是分子生物检测手段初期方法，具有操作技术要求高、易污染等缺点，已少用。其余快速诊断技术存在设备昂贵、操作严格或影响因素多等缺点，但检测效率均较传统培养法提高。因此，在检测设备及技术等方面有待深入研究，使其能向基层医疗机构普及。目前西医治疗以主流抗结核药及联合其它疗法为主。但化疗药物对患者肝[38]、肾[39]、内分泌系统、免疫系统、神经系统等多系统器官均有不同程度损伤，介入及手术治疗等运用范围局限。中医临床不乏中医药及中西医结合治疗耐药结核病疗效明显的报道[40]，但对该病的认识及治疗纷繁复杂，未形成高效规范化治疗，仍处于各家学说，百家争鸣状态。因此，需中西医及其他学科领域专家学者共同努力，进一步研究耐药结核菌的有效诊治方法。

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