对比微生物群落在3种常见胆结石胆汁中的差异性

谢宁芳

对比微生物群落在3种常见胆结石胆汁中的差异性

谢宁芳

目的 探讨常见的3种胆结石胆汁中微生物群落的差异性对比。方法 选择3种类型胆结石患者100例作为研究对象，对其运用末端限制性片断长度多态性（T-RFLP）技术，并对其胆汁细菌群落进行基因序列分析探讨。结果 （1）细菌16 Sr DNA基因片段的阳性检出率为76%，3组之间阳性检出率差异无统计学意义；（2）3组细菌16 Sr DNA基因片段分析，纯胆固醇组的细菌群落主要以肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌为主；胆色素结石组主要包括普通变形杆菌#厌氧消化球菌等；混合性结石胆汁组主要为厌氧消化球菌/丙酸杆菌，其中还包括了胆色素结石胆汁组中未检测到的黄微杆菌和希氏短杆菌。结论 胆结石患者胆汁标本中细菌检出率较高，但各组细菌群落构成各有不同，且成分较为复杂。

微生物群落；胆结石；差异性

近年来，我国的胆结石发病率呈逐渐上升趋势，目前约为5.6%[1]，就其发生机制方面来看，已然从胆汁郁滞、肺道感染及胆汁理化性质紊乱发展为了胆囊内微生物环境的改变[2]，基于此，本研究选择3种类型胆结石（即：混合性结石、纯胆固醇结石以及胆色素结石）患者，并利用末端限制性片断长度多态性技术对患者的胆囊内微生物菌落16 Sr DNA进行了统一分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取河南省长葛市人民医院2011年3月～2013年3月收治的100例3种类型胆结石患者为研究对象，其均接受择期胆囊切除术，其中男36例，女64例，患者平均年龄（55.0±5.5）岁，本院结合对胆石化学成分用红外光谱法的分析，将患者分为3组，分别为混合性结石组28例，纯胆固醇结石组50例，胆色素结石组22例。

1.2 主要仪器和试剂 为了提高实验的准确性，用了ABI 3100全自动遗传分析仪、ABI 2720 PCR热循环仪、ZF型紫外分析仪以及低温高速台式离心机MR 23 i等，Hi－Di甲酰胺，Liz 500和细菌16 Sr DNA PCR扩增试剂盒。

1.3 检测方法

1.3.1 胆汁DNA的提取 研究中，取胆汁1 mL与1 mL Buffer I，并涡旋振荡充分混匀，在此基础上，加入溶菌酶（50 g/ L）100 μL，在37℃下培育1 h，并将离心管置于液氮中5 min，继而迅速向水浴锅（65℃）转移，进行3 min解冻，进行反复3次，接下来加0.5 mL bufferⅡ，上下摇匀后，向其中加蛋白酶K共5 μL，进行1 h水浴。完成上述操作后，按照1∶1比例向上述溶液中加入比例为25∶24∶1的加酚/氯仿/异戊醇混合液，离心5 min，用1个灭菌塑料离心管吸上层水相800 μL，并将上述3种的混合液进行等体积加入，加入2倍体积的无水乙醇，离心30 min，13 000 r/min，继而将上清去弃去，进行真空干燥后，将30～50 μLTE缓冲溶液加入其中，对DNA进行充分溶解，并保存于-20℃的条件下。

1.3.2 T－RFLP分析 在此环节，本院研究人员将0.2 μL的Liz 500、10 μL Hi－Di甲酰胺与纯化、酶切后的PCR产物进行混合，继而于ABI 3130遗传分析仪中实施毛细管电泳，所取基线的荧光强度50 RFU，并对大于基线的峰高和出峰处的T－RF长度用Genemapper软件进行计算，标准化处理> 50 bp的峰面积，对其丰度进行计算，完善整个过程。

1.4 统计学方法 采用了SPSS 17.0统计学软件，率的比较采用Fisher's Exact test分析来进行，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

研究统计结果显示，参与研究的100例患者中，检出细菌16 Sr DNA基因片段的有76例，所以其对应的阳性率为76%，3组中纯胆固醇结石胆汁组阳性检出率为80%，混合性结石胆汁组为78.5%（22/28），胆色素结石胆汁组为63.6%（14/22），3组阳性检测率比较差异无统计学意义。本次研究中，在胆汁细菌16 Sr DNA PCR的T－RFLP分析方面。较高的是胆结石患者胆汁标本中的细菌，但各组细菌群落构成各有不同，具有较为复杂的成分。

3 讨论

一般情况下，可划分胆汁检测细菌为两大类，即：厌氧菌与需氧菌[3]。其中需氧菌从菌株上主要是大肠杆菌，厌氧菌从菌株上主要是丙酸杆菌、消化球菌和类杆菌等。通过测定细菌DNA序列，结果显示，纯胆固醇结石胆汁组患者细菌群落相对较为单一，主要是需氧菌。胆色素结石胆汁组与混合性结石胆汁组具有相对比较丰富的细菌群落，一方面存在需氧菌，同时还存在大量厌氧菌[4-5]。本次研究中，对于胆囊结石患者体内的胆汁标本，运用PCR技术进行了16 Sr RNA基因片段扩增，其不同于常规细菌培养分析，具有灵敏度高、特异性强等优势，能检出1个细胞或1个细菌存在的单拷贝基因，并能结合细菌染色体上16 Sr RNA这种最保守的基因序列设计引物，使得从胆汁提取的DNA中特异性能对16 Sr RNA基因片段进行的有效扩增，从后续的实验统计及分析来看，100例胆汁标本中，检出细菌16 Sr DNA基因片段的达到了76例，检出率达76%，这一结果与以前的相关研究一致[6-7]，相比于胆色素组及混合性结石组，纯胆固醇结石组中胆汁细菌阳性率更高，但3组细菌的阳性检测率间的差异比较不具统计学意义，经后续研究来看，可能是因患者有反复慢性胆囊炎发作病史所致，使得其对应的细菌阳性率较高。

厌氧菌和需氧菌是胆汁检测细菌的两大分类，前者从菌株上主要由丙酸杆菌、消化球菌等组成，后者则是以大肠杆菌为主，序列测定细菌的DNA后，统计分析显示，纯胆固醇结石胆汁组存在单一细菌群落，深入研究后发现[8-9]，其以需氧菌为主，此组外的两组，也就是混合性结石胆汁组、胆色素结石胆汁组与前组不同，其具有丰富的细菌群落，厌氧菌及需氧菌都有，本研究未测出耐胆汁酸盐菌株序列，可能与该菌在胆囊中数量过低等有关。

综上，据本院统计分析看来，就检出率方面来看，胆结石患者胆汁标本中细菌检出率较高，但各组细菌群落构成各有不同，且成分较为复杂。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.31.026

河南 461500 河南省长葛市人民医院检验科 （谢宁芳）