海南地区不孕人群HBV感染对体外受精-胚胎移植结局的影响

周立花，符免艾，李娟

(海南省农垦总医院生殖科，海南 海口 570311）

海南地区不孕人群HBV感染对体外受精-胚胎移植结局的影响

周立花，符免艾，李娟

(海南省农垦总医院生殖科，海南 海口 570311）

目的 了解海南地区不孕人群HBV的感染率，探讨男方或女方HBV感染对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)结局的影响。方法回顾性分析2009年1月至2014年12月在我院生殖科行IVF-ET助孕治疗的1 192对夫妇共1 192个周期的资料，统计男性HBsAg(+)与女性HBsAg(+)例数，了解HBV的感染率。从1 192个周期中选取男性HBsAg(+)女性HBsAg(-)123个周期为男性HBV感染组、女性HBsAg(+)男性HBsAg(-)83个周期为女性HBV感染组，随机选择男女双方均HBsAg(-)165个周期为对照组。分别比较男性HBV感染组、女性HBV感染组与对照组的精子质量、受精率、优质胚胎率、种植率和临床妊娠率等各项指标之间的差异性。结果1 192对夫妇个周期中HBV感染率为15.98%(381/2 384)。男性HBV感染组与对照组比较精子质量差异无统计学意义(P＞0.05)，2pn受精率低于对照组(56.8%vs 60.8%)，但移植日子宫内膜厚度厚于对照组[(12.06±2.95)mm vs(11.06±2.29)mm]，临床妊娠率高于对照组(41.5%vs 30.0%)，差异均有统计学意义(P＜0.05)。女性HBV感染组与对照组相比两组的种植率[24.2%(66/204)vs 30.1%(45/150)]、临床妊娠率(37.5%vs 30.0%)等指标比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论海南地区不孕人群HBV的感染率偏高，但无论是男方还是女方感染HBV均未影响IVF助孕结局。

海南地区；乙型肝炎；精子质量；体外受精-胚胎移植

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个全球性的公共健康问题。据世界卫生组织统计，全世界约20亿人感染过乙肝病毒，其中约3.5亿为慢性感染，而中国属于HBV感染的高流行地区[1]。HBV虽然是嗜肝病毒，也可感染肝外其他组织，如女性的卵巢[2-3]和男性的睾丸、附睾中均能发现HBV-DNA[4]。因此，乙型肝炎病毒可能通过配子直接传给后代，也有可能影响精子和卵子质量，从而影响体外受精胚胎移植(IVF-ET)助孕结局。本文通过统计本院生殖科HBV的感染率，大致了解HBV感染在海南不孕人群中的发病率，并且通过与正常人群对比了解HBV感染是否影响体外受精胚胎移植助孕结局。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2009年1月至2014年12月在我院生殖科就诊进行IVF-ET治疗的夫妇1 192对，共1 192个新鲜周期资料，男女双方均行HBsAg检测。选择以长方案或改良超长方案促排卵的周期，并排除女方患多囊卵巢综合征(PCOS)、子宫内膜异位症或夫妇双方有支原体、衣原体感染。根据以上标准从1 192个周期中选取男性HBsAg(+)女性HBsAg(-)123个周期为男性HBV感染组、女性HBsAg(+)男性HBsAg(-)83个周期为女性HBV感染组，随机选择男女双方均HBsAg(-)165个周期为对照组。

1.2 方法

1.2.1 控制性超促排卵方案 (1)常规长方案：上一次月经黄体中期开始应用长效促性腺激素释放激素类似物(达菲林)降调节。(2)改良超长方案：在第一次降调同常规长方案，28 d再次予长效达菲林降调一次。达到降调节标准后[卵泡刺激素(FSH)≤5 mlU/mL，促黄体生成素(LH)≤5 mIU/mL，雌二醇≤50 pg/mL，内膜≤5 mm，卵泡直径≤5 mm]，应用促性腺激素进行促排卵。按B超检测结果和血浆内分泌激素水平调整促性腺激素(Gn)的用量。当1个卵泡平均直径＞18 mm、或3个卵泡平均直径＞17 mm、或4个卵泡直径＞16 mm时给予人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射，36～37 h取卵。

1.2.2 精液处理 采用世界卫生组织推荐的相关标准，对精液进行精液常规分析及采用精子形态快速染色法，对精子染色后于显微镜下进行严格的形态学检查；采用密度梯度离心法进行精液洗涤，并经过上游处理。根据精子质量、既往妊娠史，不孕年限等因素综合考虑，选择行IVF、IVF+ICSI或直接ICSI受精。

1.2.3 胚胎体外培养 胚胎卵裂期评分标准根据取卵后胚胎形态和碎片多少，将胚胎分为4级。标准如下：Ⅰ级，细胞大小均匀，形态规则，透明带完整，胞质清晰，无颗粒现象，碎片＜5%卵裂球面积；Ⅱ级，细胞大小略不均，形态略不规则，胞质可有颗粒现象，碎片10%～20%；Ⅲ级，细胞大小明显不均，可有明显的形态不规则，胞质可有颗粒现象，碎片21%～50%；Ⅵ级，细胞大小严重不均，胞质可有严重的颗粒现象，碎片＞50%。若胚胎发育速度过慢或过快，即第2天＜3个卵裂球或≥6细胞，第3天＜6细胞或≥10细胞，则卵裂期胚胎评分降级。我们将取卵后第3天卵裂球数目超过6和碎片小于20%的胚胎认为是优质胚胎[5]。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，两样本计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料用率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HBV感染率 1 192个周期中男性HBsAg (+)223人，女性HBsAg(+)158人，夫妇双方均HBsAg (+)68人(34对)，HBV总感染率为15.98%[(223+158)/ 2 384)]。其中男性HBV感染率为18.71%(223/1 192)，女性为13.26%(158/1 192)。

2.2 男性HBV感染对IVF-ET影响 男性HBV感染组与对照组比较，双方年龄，不孕年限、女方体质量指数(BMI)、原发或继发不孕等因素比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，男方精液量、精子密度、前向运动精子比和正常精子比率两组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，两组Gn用量、获卵数、受精方式、优胚率、种植率比较差异也均无统计学意义(P＞0.05)。对照组2pn受精率高于HBV感染组(56.8%vs 60.8%，P= 0.019)，但是男性HBV感染组移植日子宫内膜厚度大于对照组[(12.06±2.95)mm vs(11.06±2.29)mm，P= 0.002)，临床妊娠率高于对照组(41.5%vs 30.0%，P= 0.012)，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.3 女性HBV感染对IVF-ET的影响 女性HBV感染组与对照组比较，双方年龄，不孕年限、BMI，原发或继发不孕等因素比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，男方精液量、精子密度、前向运动精子比和正常精子比率两组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。两组在Gn用量、获卵数、受精方式、2pn受精率、优胚率、种植率、移植日子宫内膜厚度和临床妊娠率等方面比较差异也均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表1 男性HBV感染组与对照组各项指标比较(±s)

表1 男性HBV感染组与对照组各项指标比较(±s)

基本情况女方年龄(岁)男方年龄(岁)不孕年限(年)原发:继发BMI精液量精子密度前向运动精子比精子正形率(%) Gn用量ET日内膜厚度(mm)获卵数2pn受精率(%)优胚率(%)临床妊娠率(%)种植率(%)受精方式IVF ICSI IVF+ICSI男方HBsAg(+) 33.09±4.67 35.89±5.25 5.49±3.59 42:81 21.22±2.43 2.24±0.82 77.32±53.03 48.21±17.65 8.06±4.77 2486.18±678.23 12.06±2.956 11.13±6.09 56.8 38.1 41.5(51/123) 32.4(66/204)对照组33.88±4.72 36.88±5.94 5.01±3.33 49:115 21.75±2.64 2.25±0.74 71.65±47.45 44.73±17.56 7.51±4.27 2486.74±649.11 11.06±2.29 11.42±6.10 60.8 35.0 30(45/150) 30.1(89/296) t值/χ2值-1.41 -1.48 1.161 0.645 -1.782 -0.109 0.952 1.659 0.974 -0.007 3.057 -0.405 5.495 1.97 6.386 0.295 2.093 P值0.160 0.140 0.247 0.422 0.085 0.914 0.342 0.098 0.331 0.994 0.002 0.686 0.019 0.160 0.012 0.587 0.351 62 35 23 76 43 43

表2 女性HBV感染组与对照组各项指标比较(±s)

表2 女性HBV感染组与对照组各项指标比较(±s)

基本情况 女方HBsAg(+)对照组女方年龄(岁)男方年龄(岁)不孕年限(年)原发:继发34.21±4.89 37.19±6.18 5.63±4.04 26:57 33.88±4.72 36.88±5.94 5.01±3.33 49:115 t值/χ2值P BMI精液量精子密度前向运动精子比精子正形率(%) Gn用量21.32±2.48 2.21±0.55 87.54±63.55 44.52±18.50 8.79±5.73 2490.66±753.11 21.75±2.64 2.25±0.74 71.65±47.45 44.73±17.56 7.51±4.27 2486.74±649.11 0.507 0.716 1.275 0.055 -1.232 -0.588 2.192 0.241 1.91 0.042 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0值ET日内膜厚度(mm)获卵数2pn受精率(%)优胚率(%)临床妊娠率(%)种植率(%)受精方式IVF ICSI IVF+ICSI 11.41±3.11 10.99±5.95 59(538/912) 38.1(190/538) 37.5(30/80) 24.2%(38/157) 11.06±2.29 11.42±6.10 60.8 35.0 30(45/150) 30.1%(89/296) 0.963 -0.536 0.885 0.020 1.335 1.748 2.332 .613 .716 .203 .815 .219 .557 .029 .810 .057 .966 0.337 0.592 0.347 0.887 0.248 0.186 0.312 44 24 15 76 43 43

3 讨 论

在我院生殖科行IVF-ET助孕的夫妇需常规检测是否有乙肝病毒携带，据我们的资料统计，IVF就诊夫妇中HBV感染率为15.98%[(223+158)/2 384]，远高于我国1992年流行病学调查所显示的1～59岁人群HBV感染率9.8%[6]。其中男性HBV感染率为18.7%(223/1 192)，也高于国内其他学者所报道的ART中男性HBV的感染率，如费前进等[7]报道的1 208对ART夫妇中男方HBV感染率为13.9%，武新梅等[8]报道的温州地区1 268对ART夫妇男方HBV感染率为15.1%。这可能与海南地区生活习惯、经济状况和人口流动较大相关。

通过检查HBV感染男性患者的睾丸和附睾组织，发现不同发育阶段的生精细胞和支持细胞均能检测到HBV-DNA[4]。用HBV感染精子行人精子去透明带金黄地鼠卵穿透试验获得精子染色体，发现染色体异常显著增加，而且还表现出僵硬、转曲和不易上色的特点[9]。因此推测HBV感染除了可能将HBV病毒通过精子直接传染给后代外，还能影响精子质量。但是我们通过对比男性HBV感染组与对照组的精液量，精子密度、前向精子比率和正常精子比率，两组之间均无统计学差异。这个结果不同于有些研究者的报道，他们的研究结果显示HBV感染会使精子的密度减少、活力偏低和畸形率升高[10-11]。HBV导致精子质量异常的可能机制是：乙肝病毒作用于精子前的各级生精细胞，导致生精细胞调亡的增加，可诱导精子凋亡通路中的早期变化的发生，导致细胞膜完整性受损和通透性增加[12]。还可以整合到精子DNA，导致精子染色体的不稳定，诱导基因突变，造成精子DNA损伤和染色体异常[13]。

随着不孕不育人群的增多，乙肝患者夫妇求助辅助生殖技术的人数也在不断的增加。但HBV感染对是否对辅助生殖技术助孕结果有影响，目前存在很大的争议。HBV可以进入男性精子，整合进入人的基因组[14]。携带有乙肝病毒的精子可以穿过透明带，进入卵母细胞的细胞质，受精后，在胚胎的早卵裂期就表达HBV的mRNA和蛋白[15]。HBV感染的女性在卵子和胚胎中也能检测出HBV-DNA[16-17]。研究报道HBV的感染会降低IVF/ICSI的受精率、胚胎种植率和妊娠率[18-19]，并会提高妊娠早期流产率[20-21]，甚至还有报道认为女性HBV感染与分娩时孕周相关[22]。相反，Lee等[23]发现尽管男性HBV阳性患者的精子正常形态率显著降低，但行IVF治疗的临床种植率和妊娠率无显著降低，用HBV感染的男性精子与供卵结合后，与对照组比较，受精率和临床妊娠率也差异无统计学意义[24]。还有研究认为HBV感染组有更高的种植率(43.3%vs 18.4%，P＜0.01)和继续妊娠率(53.3%vs 24.2%，P＜0.01)[21]。本研究中，男性HBV感染组精子质量与对照组比较差异无统计学意义，说明HBV感染未影响到精子质量。虽然男性HBV感染组2pn受精率低于对照组，但妊娠率高于对照组(41.5%vs 30.0%，P＜0.05)，差异有统计学意义，这可能与移植日子宫内膜厚度大于对照组有关(12.06±2.95 vs 11.06±2.29)，而是否与乙肝感染关系不明确。我们的研究能证明男性HBV感染不会降低IVF-ET的临床妊娠率。而女性乙肝组的2pn受精率，种植率和妊娠率与对照组比较差异无统计学意义。虽然目前有很多关于HBV感染对辅助生殖技术结局影响的研究报道，但是是否有影响仍有争议，影响的机制仍不明确。由于样本量和研究人群的不同，HBV感染程度不同，以及精子和卵子和胚胎的修复作用，各个研究者给予的结论也不完全相同。

我们研究显示，海南地区不孕人群HBV感染率偏高。无论男方还是女方HBV感染，均未影响体外受精辅助生殖技术的结局，HBV感染的患者同正常人群一样，可以通过辅助生殖技术帮助解决生育问题。

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Impact of HBV infection on the outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer in Hainnan province.

ZHOU Li-hua,FU Mian-ai,LI Juan.Department of Reproduction,Hainan Provincial Nongken General Hospital,Haikou 570311, Hainan,CHINA

ObjectiveTo examine the prevalence of hepatitis B virus(HBV)infection in the infertile couples in Hainan province,and to analyze the effect of HBV infection on the outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET).MethodsA retrospective analysis was performed on 1 192 couples receiving IVF-ET(1 192 cycles) form January 2009 to December 2014 in Hainan Provincial Nongken General Hospital.The number of males and females with HBsAg(+)was recorded,and the prevalence of HBV infection was examined.One hundred and twenty-three cycles of male HBsAg(+)and female HBsAg(-)were selected as male HBV infected group,and 83 cycles of female HBsAg(+)and male HBsAg(-)were selected as female HBV infected group,with 165 cycles of male HBsAg(-)and female HBsAg(-)as the control group.Sperm quality,fertilization rate,high-quality embryo rate,implantation rate,and clinical pregnancy rate were compared between male HBV infected group and control group,female HBV infected group and control group.ResultsThe HBV infection rate was 15.98%(381/2 384)in the 1 192 couples.Male HBV infected group and control group had no statistically significant difference in sperm quality(P＞0.05),but the two groups showed statistically significant difference in 2pn fertilization rate(56.8%vs 60.8%),endometrial thickness on the day ofembryos transferred[(12.01±2.95)mm vs(11.06±2.29)mm],and the clinical pregnancy rate(41.5%vs 30.0%),P＜0.05. Female HBV infected group and the control group showed no statistically significant difference in implantation rate [24.2%(66/204)vs 30.1%(45/150)]and clinical pregnancy rate(37.5%vs 30.0%),P＞0.05.ConclusionThe HBV infection rate of the infertile patients was relatively high in Hainan province,but neither the man nor the woman infected with HBV exerted any effect on the outcomes of IVF-ET.

Hainan province;Hepatitis B;Sperm quality;In vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET)

R512.6+2

A

1003—6350（2016）07—1044—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.005

2015-11-02)

海南省卫生厅科研项目（编号：13A200036）

李娟。E-mail：hainanjuanli@163.com