Galectin-9对卵巢癌细胞侵袭转移的影响

潘丽英，黄福海，钟雪花

(1.深圳市宝安区沙井人民医院妇产科，广东 深圳 518125；2.深圳市光明新区人民医院医学检验科，广东 深圳 518106；3深圳市宝安区沙井人民医院临床医学科，广东 深圳 518125)

Galectin-9对卵巢癌细胞侵袭转移的影响

潘丽英1，黄福海2，钟雪花3

(1.深圳市宝安区沙井人民医院妇产科，广东 深圳 518125；2.深圳市光明新区人民医院医学检验科，广东 深圳 518106；3深圳市宝安区沙井人民医院临床医学科，广东 深圳 518125)

目的探讨半乳糖凝集素-9(Galectin-9)对卵巢癌细胞侵袭转移的影响。方法将不同浓度外源性Galectin-9[0(阴性对照)、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL]加入卵巢癌SKOV3细胞中，培养48 h，Western blot法检测细胞内Galectin-9的表达，MTT法检测细胞活力，Transwell法检测细胞迁移及侵袭能力，Western blot检测基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9、上皮间充质转化(EMT)相关蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表达。结果与阴性对照比较，4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL外源性Galectin-9能显著提高卵巢癌SKOV3细胞中Galectin-9的表达(P＜0.01)；4 μg/mL、8 μg/ml、16 μg/mL外源性Galectin-9能显著降低SKOV3细胞活力[(100.00± 7.46)vs(77.92±8.03)、(60.62±6.42)、(47.63±5.41)](P＜0.01)，减少细胞迁移[(99.49±9.63)vs(78.36±8.90)、(65.42±7.32)、(50.31±6.78)]及侵袭数目[(99.13±10.30)vs(76.69±7.23)、(63.68±6.32)、(52.37±4.99)](P＜0.01)，并能显著下调MMP2、MMP9及Vimentin的表达(P＜0.01)，上调E-cadherin的表达(P＜0.01)。结论上调卵巢癌细胞SKOV3中Galectin-9的表达能显著抑制细胞迁移侵袭等恶性生物学行为，可能与下调MMPs及调节EMT相关蛋白表达有关。

半乳糖凝集素-9；卵巢癌细胞SKOV3；侵袭；转移

卵巢癌是女性生殖器官恶性肿瘤之一，其死亡率居妇科恶性肿瘤首位。作为一种严重威胁女性健康和生命的恶性肿瘤，卵巢癌具有发现晚、转移早、进展快及预后差的特点。而导致卵巢癌死亡率居高不下的主要原因是肿瘤的侵袭及转移[1-2]。半乳糖凝集素-9(Galectin-9)是半乳糖结合蛋白家族的成员之一，能特异性结合于细胞表面和细胞间质中的半乳糖，从而发挥细胞间及细胞与间质间的信号传递作用。研究证实Galectin-9与自身免疫性疾病、炎症、生殖及肿瘤等多种疾病密切相关[3]。此外大量研究报道证实Galectin-9在食管鳞状细胞癌，乳腺癌、结直肠癌，胃癌，口腔鳞癌，胶质瘤及肝癌中低表达，并与肿瘤的发生，进展、转移及预后密切相关[4]。本课题组前期研究也证实Galectin-9在卵巢癌组织、癌旁组织，卵巢良性组织中表达逐渐降低，且Galectin-9与淋巴结转移密切相关，提示Galectin-9与卵巢癌的发生，进展及淋巴结转移密切相关，可能成为卵巢癌预后的标志及基因治疗的靶点。因此，本研究在此基础上，探讨外源性Galectin-9对卵巢癌细胞侵袭转移影响的相关机制。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 卵巢癌细胞SKOV3购自中国科学院细胞库，目录号TCHu185；兔抗MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin、GADPH单克隆抗体(Epitmics公司)；兔抗Galectin-9多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；重组人Galectin-9(美国R&D公司)；胎牛血清，DMEM养基(Hyclone公司)；Transwell小室(Corning公司)。迷你双垂直电泳仪，迷你转印电泳仪(北京六一仪器厂)；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；

1.2 方法

1.2.1 MTT法 将卵巢癌细胞SKOV3接种于96孔板培养24 h后，将不同浓度外源性Galectin-9[0(阴性对照)、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL]加入细胞中，培养48 h，加入20 μL的5 mg/mL MTT，继续培养4 h，每孔加入150 μL DMSO，震荡使结晶物充分溶解，于酶标仪560 nm处测OD值，细胞相对活力(%)=(Galectin-9组OD值)/(阴性对照OD值)×100%。

1.2.2 迁移实验 将卵巢癌细胞SKOV3接种于6孔板培养24 h后，将不同浓度外源性Galectin-9[0 (阴性对照)、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL]加入细胞中，培养48 h，细胞消化加入Transwell上室，下室用含5%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养24 h，取出Transwell小室，洗涤，多聚甲醛固定，结晶紫染色，倒置光学显微镜下计数5个视野穿膜细胞个数，计算平均每个视野的细胞数，即表示细胞的侵袭能力。

1.2.3 细胞侵袭实验 将Matrigel胶均匀平铺于Transwell小室的微膜(5 μm)上，制成凝胶备用。按1.2.2进行操作，最后倒置光学显微镜下计数5个视野穿膜细胞个数，计算平均每个视野的细胞数，即表示细胞的侵袭能力。

1.2.4 Western blot将卵巢癌细胞SKOV3接种于6孔板培养24 h后，将不同浓度外源性Galectin-9[0 (阴性对照)、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL]加入卵巢癌SKOV3细胞中，培养48 h，消化收集细胞，加入RIPA裂解液，每隔10 min置于涡旋仪中震荡30 s，40 min后，离心，小心吸取上清，即可获得总蛋白。根据BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定。蛋白上样，跑SDS凝胶电泳，后湿法转膜。将膜浸入一抗溶液孵育，4℃过夜；漂洗后，浸入二抗溶液中室温孵育1～2 h。将膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件对各抗体条带灰度值进行统计。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 外源性Galectin-9对SKOV3细胞中Galectin-9表达量的影响 如图1所示，通过Western blot证实，4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL Galectin-9能显著提高卵巢癌细胞中Galectin-9的表达量(P＜0.01)。

图1 外源性Galectin-9对SKOV3细胞中Galectin-9表达量的影响

2.2 外源性Galectin-9对卵巢癌细胞SKOV3生物学行为的影响 如表1所示，4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml的Galectin-9能显著的抑制SKOV3细胞活力，减少细胞迁移及侵袭数目，差异均具有统计学意义(P＜0.01)。如表2所示，4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml Galectin-9能显著下调SKOV3细胞中MMP2、MMP9及Vimentin的表达，上调E-cadherin的表达，差异均具有统计学意义(P＜0.01)。

表1 外源性Galectin-9对卵巢癌细胞SKOV3生物学行为的影响(±s)

表1 外源性Galectin-9对卵巢癌细胞SKOV3生物学行为的影响(±s)

注：与阴性对照比较，aP＜0.01。

组别 相对细胞活力(%)细胞迁移数目 细胞侵袭数目阴性对照4 μg/mL Galectin-9 8 μg/mL Galectin-9 16 μg/mLGalectin-9 100.00±7.46 77.92±8.03a60.62±6.42a47.63±5.41a99.49±9.63 78.36±8.90a65.42±7.32a50.31±6.78a99.13±10.30 76.69±7.23a63.68±6.32a52.37±4.99a

表2 外源性Galectin-9对SKOV3细胞中MMPs、E-cadherin及Vimentin表达量的影响(±s)

表2 外源性Galectin-9对SKOV3细胞中MMPs、E-cadherin及Vimentin表达量的影响(±s)

注：与阴性对照比较，aP＜0.01。

组别阴性对照4 μg/mL Galectin-9 8 μg/mL Galectin-9 16 μg/mL Galectin-9 Vimentin/GADPH 1.12±0.11 0.84±0.08a0.64±0.06a0.44±0.05aMMP2/GADPH 1.35±0.13 1.10±0.104a0.78±0.08a0.53±0.04aMMP9/GADPH 1.01±0.10 0.83±0.05a0.73±0.06a0.41±0.04aE-cadherin/GADPH 0.20±0.02 0.31±0.02a0.64±0.04a1.00±0.11a

3 讨 论

侵袭转移是卵巢癌患者死亡的重要原因。研究发现，肿瘤转移是一个多因素、多步骤、复杂的过程，其包括细胞外基质的降解，粘附的降低，穿过血管内渗至微循环，后经微循环系统穿过血管，外渗至组织，最终转移至远处形成新的转移灶。因此细胞外基质的降解是肿瘤侵袭和转移的必要步骤，MMPs是降解细胞外基质的最重要的蛋白水解酶，在细胞肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。MMP2不仅可以降解细胞外基质中的明胶Ⅳ型胶原等，有利于肿瘤细胞沿着受损的基底膜向周围浸润，还可以通过新生毛细血管促进肿瘤的侵袭及转移。MMP9是由多种细胞分泌的一种蛋白水解酶，是MMPs中分子量最大的酶，能够降解细胞外基质和基底膜，从而增加细胞的运动能力，促进肿瘤的扩散和转移。申丽媛等[5]证实MMP2及MMP9在卵巢癌组织中的表达均高于正常卵巢组织及卵巢良性组织，并与卵巢癌的临床分期有关，提示MMP2及MMP9对卵巢癌病情演变和预后评估具有重要意义。因此下调MMP2及MMP9的表达能一定程度上抑制卵巢癌的进展及侵袭行为。EMT是转移发生的第一步，最早在胚胎发育过程中得到证实，EMT可诱导原发部位的肿瘤扩散，使得肿瘤侵犯周围组织，并通过血液循环转移至远处形成新的转移灶，是卵巢癌侵袭转移的重要分子机制。EMT的分子标志性特征为细胞间黏附分子E-cadherin消失，一系列间充质标记物的表达增加，包括波形蛋白(Vimentin)和纤连蛋白[6-7]。E-cadherin表达减少，有利于肿瘤细胞从原发部位脱落，促进肿瘤浸润扩散。Vimentin高表达可以减弱E-cadherin介导的细胞间的黏附，从而促进细胞浸润转移。E-cadherin在卵巢癌组织中低表达，Vimentin在卵巢癌组织中高表达，并与卵巢癌组织临床分期，组织学分级，淋巴结转移密切相关，通过阻断EMT的发生，能降低患病的风险[8]。因此逆转EMT相关蛋白的表达，能抑制癌细胞的侵袭转移。

Galectin-9是半乳糖结合蛋白家族的成员之一，属于动物凝集素，能够与细胞表面和细胞间质中的半乳糖特异性的结合，发挥细胞间以及细胞与间质间的信号传递作用。Galectin-9参与了机体许多生理和病理过程，包括细胞间黏附、细胞生长调节、炎症反应和免疫调节等。Galectin-9广泛分布于人体多数组织，包括脑、乳腺、胃、肝脏、胰岛细胞、肺脏、子宫、扁桃体和多种免疫细胞。已报道Galectin-9在食管鳞状细胞癌，乳腺癌、结直肠癌、胃癌、口腔鳞癌、胶质瘤及肝癌中低表达，并与肿瘤的发生、进展、转移及预后密切相关[4]。Chan等[9]证实Galectin-9在口腔鳞癌中低表达，并在有淋巴结转移中的阳性表达低于无淋巴结转移。Zhang等[10]证实肝细胞癌中Galectin-9的表达与淋巴结转移，血管侵袭及肝内转移密切相关，且阳性表达Galectin-9的肝细胞癌患者有更长的生存时间。以上的报道说明了Galectin-9的表达与肿瘤的结转移密切相关。本课题先前研究也证实Galectin-9与卵巢癌的淋巴结转移密切相关。本研究在此基础上探讨了外源性Galectin-9对卵巢癌细胞SKOV3侵袭转移能力的影响，结果表明，4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml Galectin-9能显著的抑制卵巢癌细胞SKOV3的迁移侵袭能力，并下调MMP2、MMP9及Vimentin的表达，上调 E-cadherin的表达。Nobumoto等[11]证实将Galectin-9静脉注射到高转移性B16F10胶质瘤细胞及Colon26结肠癌细胞小鼠模型中，结果发现转移瘤小鼠中肺转移受到抑制，粘附分子的表达上升，从而抑制肿瘤细胞粘附到血管内皮及细胞外基质。从而提示外源性Galectin-9能显著抑制卵巢癌的侵袭转移，与调节MMPs及EMT相关蛋白表达有关。

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Effect of Galectin-9 on invasion and metastasis of ovarian cancer cells SKOV3.

PAN Li-ying1,HUANG Fu-hai2, ZHONG Xue-hua3.1.Department of Gynaecology and Obstetrics,Shajing People's Hospital of Baoan District of Shenzhen, Shenzhen 518125,Guangdong,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,People's Hospital of Guangming New District of Shenzhen,Shenzhen 518106,Guangdong,CHINA;3.Department of Clinical Medicine,Shajing People's Hospital of Baoan District of Shenzhen,Shenzhen 518125,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore effect of Galactose lectin-9(Galectin-9)on invasion and metastasis in ovarian cancer cells SKOV3.MethodsSKOV3 cells were treated with different concentrations of exogenous Galectin-9[0(negative control),4 μg/mL,8 μg/mL,16 μg/mL]for 48 h.The expression of Galectin-9 in SKOV3 cells was detected by Western blot.Cell viability was measured by MTT assay,and the ability of cell migration and invasion was detected by transwell assay.The expression of matrix metalloproteinase 2(MMP2),MMP9,EMT related proteins E-cadherin and Vimentin was detected by Western blot.ResultsCompared with negative control,4 μg/mL,8 μg/mL,16 μg/mL Galectin-9 upregulated the expression of Galectin-9 in SKOV3 cells(P＜0.01),and inhibited SKOV3 cells viability[(100.00±7.46)vs (77.92±8.03),(60.62±6.42),(47.63±5.41),P＜0.01],migration[(99.49±9.63)vs(78.36±8.90),(65.42±7.32),(50.31±6.78), P＜0.01]and invasion[(99.13±10.30)vs(76.69±7.23),(63.68±6.32),(52.37±4.99),P＜0.01],as well as down-regulated the expression of MMP2,MMP9 and Vimentin(P＜0.01)and upregulated the expression of E-cadherin(P＜0.01).ConclusionOverexpresion of Galectin-9 in SKOV3 cell could inhibit cell migration,invasion and metastasis,which is associated with down-regulation of the expression of MMPs and regulation of the expression of EMT related proteins.

Galactose lectin-9;Ovarian cancer cells SKOV3;Invasion;Metastasis

R737.31

A

1003—6350（2016）07—1039—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.003

2015-10-30)

广东省深圳宝安区科技计划社会公益项目(编号：2015230)

潘丽英。E-mail：panliying630@126.com