允许性高碳酸血症对大鼠肢体缺血再灌注肺损伤的影响

卫琰，朱刚，奚栋华，周晓鸣，李立志

（上海市浦东新区人民医院麻醉科，上海 201299)

允许性高碳酸血症对大鼠肢体缺血再灌注肺损伤的影响

卫琰，朱刚，奚栋华，周晓鸣，李立志

（上海市浦东新区人民医院麻醉科，上海 201299)

目的 研究允许性高碳酸血症对大鼠肢体缺血再灌注肺损伤的影响。方法30只SD大鼠，按随机数字法将大鼠随机分为假手术组(SH组)、缺血再灌注组(IR组)和允许性高碳酸血症-缺血再灌注组(PHC-IR组)，每组各10只。经腹腔全麻后对PHC-IR组实行高碳酸通气模式（吸入10%CO2+90%空气混合气体)3 h，使该实验组大鼠血气PaCO2达到并维持于60～80 mmHg。其余两组，吸空气3 h。IR组和PHC-IR组建立缺血再灌注模型，分离股动脉后阻断双侧股动脉血流4 h后(再灌前)，松夹，恢复血流后观察4 h(再灌后)，SH组仅手术分离双侧股动脉，记录各组大鼠机械通气前、机械通气后3 h、再灌注前、再灌注后的血气分析。后处死大鼠，取左肺下叶组织，行肺湿干值(W/D)测定，光镜下观察肺组织形态，采用酶联免疫吸附法测定肺组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-8的水平。结果再灌注后PHC-IR组PaO2值为(70.7±6.8)mmHg，较IR组的(60.7±4.9)mmHg明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；PHC-IR组大鼠肺组织W/D值为(4.86±0.53)，明显低于IR组的(5.64±0.74)，差异有统计学意义(P＜0.05)；IR组大鼠肺毛细血管扩张充血，肺泡间质水肿，并有炎性细胞浸润；SH组和PHC-IR组大鼠的肺泡结构较完整，肺间质肺泡腔渗出水肿较IR组减轻。PHC-IR组大鼠肺组织中TNF-α为(0.44±0.06)µg/L，IL-8为(28.3±2.6)µg/L，均明显低于IR组的(0.83±0.18)µg/L和(33.4±3.8)µg/L，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论允许性高碳酸血症可以减轻大鼠肢体缺血再灌注肺损伤，其机制可能与抑制炎性反应有关。

允许性高碳酸血症；肢体缺血再灌注；肺损伤

外科过程，包括肢体血管的重建或者使用止血带的手术，会使肢体处于一个长时间的缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)的过程。再灌注损伤会激发一个系统性炎症反应，以促炎介质产物和多形核白细胞聚集为特征。在远端肢体IR后，激活的多形核细胞因子在肺毛细血管的聚集从而引起肺损伤。允许性高碳酸血症(permissive hypercapnia，PHC)作为一种肺通气保护性策略，在某些肺疾病，如成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性气道阻塞和支气管哮喘患者机械通气中应用取得较好的效果。允许性高碳酸血症对油酸致急性肺损伤有一定保护作用[1]，但是对肢体缺血再灌注引起的急性肺损伤是否具有一定疗效，可否作为缺血预处理的一种措施尚缺乏研究。本研究通过大鼠肢体缺血再灌注损伤模型的建立，探寻PHC能否减轻肢体缺血再灌注对肺的损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠30只(上海市第六人民医院动物实验室提供)，体质量200～300 g。

1.2 药品试剂 白介素-8(IL-8)测定试剂盒、α肿瘤坏死因子测定试剂盒(均购于西门子公司)。

1.3 动物分组 按照随机数字法将实验动物随机分为三组，假手术组(SH组)、缺血再灌注组(IR组)、允许性高碳酸血症-缺血再灌注组(PHC-IR组)，每组各10只。

1.4 高碳酸血症模型建立 三组大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔内注射麻醉后，置于手术台上仰卧位固定，气管插管，接动物呼吸机行机械通气，呼吸频率60次/min，潮气量15～20 mL/kg，吸呼比(I:E)为1:2。SH组和IR组，吸空气3 h，维持二氧化碳分压(PaCO2)35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，PHC-IR组实行高碳酸通气模式，吸入10%CO2+90%空气混合气体(购于上海浦江特种气体有限公司)3 h，使该实验组大鼠血气PaCO2达到并维持于60～80 mmHg。

1.5 缺血再灌注模型建立 通过手术分离双侧股动脉，假手术组进行分离不钳夹，IR组以及PHC-IR组均采用无创血管夹钳夹双侧股动脉4 h。IR组和PHC-IR组钳夹4 h后进行再灌注过程：去除血管夹，恢复血流，观察4 h。后处死各组大鼠。

1.6 检测指标 (1)记录各组大鼠机械通气前、机械通气后3 h、阻断双侧股动脉血流4 h(再灌前)、恢复血流后4 h(再灌后)的血气分析。(2)肺组织炎症反应各项指标：①肺水含量：取左肺一小块肺组织，用电子天平称湿重，后置70℃烤箱中烘烤48 h，再用电子天平称干重，计算肺组织湿干重比值(W/D比)，公式W/D=肺湿重/烘干后重量。②采用酶联免疫吸附法测定肺组织中IL-8浓度和TNF-α浓度。③肺组织病理形态：左肺组织以10%中性福尔马林浸泡固定、石蜡包埋，HE染色。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学处理，对各组数据进行正态性检验及方差齐性检验。计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组之间比较采用独立样本t检验，多组之间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 动脉血氧分压比较 三组大鼠通气前PaO2比较差异无统计学意义(P＞0.05)，通气3 h后IR组和PHC-IR组PaO2较SH组有降低，但是三组之间比较差异无统计学意义。再灌注前，PHC-IR组PaO2较IR组升高(P＜0.05)，与SH组差异无统计学意义(P＞0.05)；再灌注后，PHC-IR组的PaO2值比SH组有降低(P＜0.05)，但高于IR组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠动脉血氧分压分析(±s，mmHg)

表1 各组大鼠动脉血氧分压分析(±s，mmHg)

注：与SH组比较，aP＜0.05；与IR组比较，bP＜0.05。

例数组别 通气前 通气后3 h 再灌注前 再灌注后SH组IR组PHC-IR组F值P值10 10 10 84.2±5.3 84.5+4.7 85.3±5.8 0.301 0.742 83.7±3.8 80.7±6.4 81.3±4.7 1.282 0.294 84.1±3.8 75.5±6.1 80.4±7.2b9.836 0.01 78.3±4.3 60.7±4.9 70.7±6.8ab27.275 0.000

2.2 肺组织湿重与干重比值 测定三组大鼠肺组织湿重与干重比值，SH组为(4.18±0.63)，IR组为(5.64±0.74)，PHC-IR组为(4.86±0.53)。与SH组比较，IR组，PHC-IR组肺组织W/D比值均有升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与IR组比较，PHC-IR组肺组织W/D比值降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 TNF-α和IL-8测定 与SH组比较，IR组、PHC-IR组肺组织匀浆中IL-8、TNF-α均有升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与IR组比较，PHC-IR组肺组织匀浆中IL-8，TNF-α比值降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 各组大鼠肺组织匀浆中TNF-α和IL-8水平比较(±s，µg/L)

表2 各组大鼠肺组织匀浆中TNF-α和IL-8水平比较(±s，µg/L)

组别 例数IL-8TNF-α SH组IR组PHC-IR组F值P值10 10 10 11.2±2.3 33.4±3.8ab28.3±2.6a67.312 0.000 0.32±0.21 0.83±0.18ab0.44±0.06a98.542 0.000

2.4 光镜下形态学差异 光镜下可见假手术组的肺泡结构无破坏，肺泡壁完整、光滑，肺间质无水肿，无中性粒细胞浸润。缺血再灌注组可见肺泡结构严重破坏，肺泡内以及肺泡壁大量充血，肺间隔严重增厚，肺泡腔和间质水肿明显，并可见中性粒细胞浸润。允许性高碳酸血症-缺血再灌注组肺组织改变较IR组有减轻，见图1。

图1 三组大鼠肺组织光镜下形态差异

3 讨 论

缺血/再灌注肺损伤是指肺组织或其他组织器官遭受一定时间缺血后恢复血液灌流(再灌注)，肺组织损伤程度迅速增剧的病理现象[2]。外科手术，包括肢体血管的重建或者使用止血带的手术，会使肢体处于一个长时间的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)的过程，再灌注损伤会激发一个系统性炎症反应，以促炎介质产物和多形核白细胞聚集为特征[3]。在远端肢体I/R后，激活的多形核细胞因子在肺毛细血管的聚集对于肺损伤以及急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的产生起到关键性的作用[4]。

肢体缺血/再灌注引起肺损伤的机制包括：(1)自由基的作用：在再灌注早期大量氧自由基的产生已被认为导致组织损伤的主要机制[5]。(2)中性粒细胞的作用：分解细胞外基质，破坏血管屏障，毛细血管通透性增加，造成肺损伤和功能障碍；同时与内皮细胞(endothelial cell，EC)相互作用，释放大量的细胞因子和炎性介质，如TNF-α、IL-1、IL-8、IL-6等，引发炎症的级联反应[6]。(3)致炎小分子物质的作用：致炎因子与抗炎因子平衡失调。(4)细胞凋亡的作用：使肺泡一毛细血管膜损伤，引起间质性肺水肿、肺泡水肿、肺出血导致肺脏气体交换障碍[7]。

在本研究中，经过缺血再灌注过程后，IR组和PHC-IR组，其动脉血氧分压较SH组均有下降，表明肢体缺血再灌注过程会对肺产生一定损伤。但是，PHC-IR组较IR组肺损伤程度减轻，其氧分压值较IR组下降减少，表明允许性高碳酸血症可以从一定程度上减轻肢体缺血再灌注对肺脏的损伤，但是却不能预防损伤的产生。

允许性高碳酸血症作为一种肺通气的保护策略在成人某些肺疾病，如成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性气道阻塞和支气管哮喘患者机械通气中应用取得较好的效果，明显降低了气漏、肺实质损伤及脱机困难等并发症的发生[8]。高碳酸血症下会对机体产生一系列的影响。高碳酸性酸中毒可引起肺血管收缩，它引起的收缩作用比低氧引起的收缩作用弱，并可在肺缺血时加强肺血管收缩。同时偏酸血液再灌注对中性粒细胞活化的抑制使IL-8含量降低，从而减轻再灌注引起的炎性反应，其机制可能为：(1)偏酸血液可抑制细胞膜上Na+/H+交换蛋白的激活，从而减少中性粒细胞的活化，抑制自由基产生，减轻肺组织脂质过氧化反应；(2)减轻钙超载；(3)偏酸血液再灌注时，可通过影响细胞膜上的脂多糖与其受体结合，终止刺激信号转导，抑制TNF-α生成，从而减轻炎性反应[9]。本研究中，免疫酶联法监测三组大鼠肺组织中的炎症反应因子(TNF-α和IL-8)，发现PHC-IR组较IR组明显下降，可见允许性高碳酸血症这一通气模式可以通过减轻肺脏的炎症反应，达到肺保护的目的。

综上所述，采取允许性高碳酸血症这一肺通气模式作为缺血预处理，可以有效地减轻肢体缺血再灌注对肺脏的损伤。

[1]杨丽丽,刘志,戢新平,等.高碳酸血症对急性肺损伤动物模型的保护作用[J].中华结核和呼吸杂志,2004,27(4):275-277.

[2]顾晴,何建国,程显声.缺血/再灌注肺损伤动物模型的建立方法[J].中华实验外科杂志,2001,18(2):191-192.

[3]Chatterjee PK.Novel pharmacological approaches to the treatment of renal ischemia/reperfusion injury[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2007,376(1-2):1-43.

[4]Denis WH,Aires AB,Kevin MC,et al.Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects against acute lung injury[J].J Vasc Surg,2002,35:1264-1273.

[5]Seekamp A,Mulligan MS,Till GO,et a1.Requirements for neutmphil products and L-arginine in isehemia-reperfusion injury[J].AmJ Pathol,1993,142(4):1217-1226.

[6]Demiryurek AT,Wadsworth RM.Superoxide in the pulmonary circulation[J].Pharmacol Ther,1999,84(3):355-365.

[7]门秀丽,张连元,董淑云,等.牛磺酸对大鼠肢体缺血/再灌注后肺损伤时细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志,2004,20(3): 421-424.

[8]Finn A,Naik S,KIein N,et a1.Intedeukin-8 release and neutrophil dogranulotion after cardiopulmonary bypass[J].J Thorac cardiovasc Surg,1993,105(2):234-241.

[9]Huber AR，Kunkd SL,Todd RF 3rd，et a1.Regulation of trang endothelial neutrophil migration by endogenous interleukin-8[J].Science,1991,254(5028):99-102.

Protective effects of permissive hypercapnia on lung injury induced by ischemia-reperfusion of hind limbs in rats.

WEI Yan,ZHU Gang,XI Dong-hua,ZHOU Xiao-ming,LI Li-zhi.Department of Anesthesiology,Shanghai Pudong New Area People's Hospital,Pudong 201299,Shanghai,CHINA

ObjectiveTo observe the protective effects of permissive hypercapnia on lung injury induced by ischemia-reperfusion of hind limbs in rats.MethodsA total of 30 male SD rats were randomly divided into the sham-operated group(SH group),the ischemia reperfusion group(IR group),and the permissive hypercapnia-ischemia-reperfusion group(PHC-IR group),with 10 rats in each group.PHC-IR group was treated with hypercapnic ventilation mode after general anesthesia(inhalation of 10%CO2+90%air-gas mixture)for 3 hours,so that the rats'blood Pa-CO2was maintained at 60～80 mmHg.The remaining two groups received general ventilation mode(air)for 3 hours.IR group and PHC-IR group established ischemia reperfusion injury model,isolated femoral artery,and block double side for 4 hours(before reperfusion).After blood flow was recovered and observed for 4 hours(after reperfusion),SH group only underwent surgery separation femoral artery.Artery blood gas analysis was recorded before mechanical ventilation, mechanical ventilation for 3 hours,before reperfusion,and after reperfusion.After rats were killed,the left lower lobe of the lung tissue was removed,the Wet/Dry weight ratio was determined,tumor necrosis factor(TNF)-α and interleukin (IL)-8 levels in lung tissue were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsCompared with IR group, the PaO2value of PHC-IR group significantly increased after reperfusion((70.7±6.8)mmHg vs(60.7±4.9)mmHg,P＜0.05);W/D ratio in lung tissue of rats in the PHC-IR group was significantly reduced((4.86±0.53)vs(5.64±0.74),P＜0.05).There was dilated congestive lung capillaries,the alveolar interstitial edema and inflammatory cell infiltration in IR group;but in SH group and PHC-IR group,alveolar structure were more complete,interstitial pulmonary edema of alveolar exudate were reduced.TNF-α and IR IL-8 levels in PHC-IR group were significantly decreased than IR group ((0.44±0.06)µg/L vs(0.83±0.18)µg/L;(28.3±2.6)µg/L vs(33.4±3.8)µg/L,P＜0.05).ConclusionThe permissive hypercapnia reduced lung injury induced by ischemia-reperfusion of hind limbs in rats and its mechanism may be related to inhibiting the inflammatory response.

Permissive hypercapnia;Ischemia-reperfusion of hind limbs;Lung injury

R-332

A

1003—6350（2016）18—2934—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.18.004

2016-04-11)

上海市浦东新区人民医院科研资助项目（编号：E12-02）

卫琰。E-mail：xiancairousi@163.com