SOX2在宫颈癌中的表达及其临床意义

赵宗霞，陈庆，王治荣，相萌，李芬霞，梁婉琪，加秋萍，张美

(1.西安医学院第二附属医院妇产科，陕西 西安 710038；2.西安交通大学第二附属医院妇产科，陕西 西安 710005；3.西北工业大学医院妇科，陕西 西安 710072；4.西安医学院临床医学系妇产科教研室，陕西 西安 710021)

SOX2在宫颈癌中的表达及其临床意义

赵宗霞1，陈庆2，王治荣3，相萌4，李芬霞1，梁婉琪1，加秋萍1，张美1

(1.西安医学院第二附属医院妇产科，陕西 西安 710038；2.西安交通大学第二附属医院妇产科，陕西 西安 710005；3.西北工业大学医院妇科，陕西 西安 710072；4.西安医学院临床医学系妇产科教研室，陕西 西安 710021)

目的 探讨肿瘤干细胞相关基因SOX2在宫颈癌中的表达情况及其临床意义。方法选取西安医学院第二附属医院妇产科2012年1月至2015年6月住院手术治疗的58例宫颈癌患者的宫颈癌组织作为宫颈癌组，同时选取同一患者的正常宫颈组织作为对照组，检测两组标本组织中SOX2表达的差异。结果宫颈癌组标本的SOX2蛋白阳性率为62.07%(36/58)，明显高于对照组的6.90%(4/58)，差异有统计学意义(P＜0.05)；宫颈癌组标本的SOX2 mRNA表达水平为(14.28±3.41)，明显高于对照组的(1.32±0.61)，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；高分化宫颈癌组标本的SOX2蛋白阳性率为34.29%(12/35)，明显低于中、低分化宫颈癌组的82.61%(19/23)，差异有统计学意义(P＜0.05)；SOX2蛋白在不同年龄(年龄≥60岁与＜60岁)、不同病理类型(鳞癌、腺癌)、不同临床分期中的表达阳性率比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论SOX2在宫颈癌组织中的表达明显高于正常宫颈组织，并且与肿瘤分化程度呈负相关。

SOX2；宫颈癌；肿瘤分化；临床意义

目前，恶性肿瘤是世界范围内威胁人类健康的主要疾病之一，而宫颈癌仅次于乳腺癌，是全球妇女第二高发恶性肿瘤，其发病率在发展中国家居首位。Parkin等[1]曾报道全世界每年新发生宫颈癌病例数约为46.5万(占女性新发癌症病例的15%)，其中我国每年新发病例约13.15万，约占总数的1/3。宫颈癌早期患者可无明显症状、体征，妇科检查患者宫颈可光滑或伴鳞-柱状上皮异位，随着疾病进展，患者可出现异常阴道出血、阴道溢液等症状，晚期患者症状则与病灶累及范围有关，患者可能出现尿频、尿急、便秘、下肢肿痛等症状，严重影响患者生存质量及寿命。宫颈癌早期诊断是其诊治的关键，目前临床常通过宫颈刮片细胞学检查、宫颈和宫颈管活组织检查以及肿瘤标志物检测等来完成[1]。SOX2是与肿瘤干细胞相关的重要干性基因，其维持干细胞的自我更新及多潜能性，与干细胞的自我更新、分化有关，可能是宫颈癌发生、发展、复发及耐药的重要参与因子[2]。本文旨在分析SOX2在宫颈癌组织中的表达情况及其在宫颈癌的发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取西安医学院第二附属医院妇产科2012年1月至2015年6月手术治疗且符合以下纳入和排除标准的58例宫颈癌患者的组织标本作为研究对象(宫颈癌组)，同时选取同一患者正常的宫颈组织作为对照组。患者年龄38～75岁，平均(49.52±10.74)岁；病理类型：鳞癌46例、腺癌12例；国际妇产科联盟(FIGO)分期：Ⅰ期51例、Ⅱ期7例；分化程度：高分化35例、中分化18例、低分化5例。

1.2 纳入和排除标准 (1)纳入标准：所有患者均为在我院妇产科完成手术治疗并进行术后病理检查确诊,且未行术前放、化疗及免疫治疗的宫颈癌患者。(2)排除标准：合并其他部位的恶性肿瘤疾病及手术记录不全或病理标本未确诊的宫颈癌患者。

1.3 实验仪器及试剂 选用上海弗鲁克流体机械制造公司生产的电动组织匀浆机；选用苏州净化设备厂生产的超净工作台；选用美国Beckmna公司生产的台式低温高速离心机；选用美国Bio-Rad公司生产的PCR仪；选用日本OLYMPUS公司生产的光学显微镜及倒置显微镜；选用美国Santa Cruz公司生产的SOX2羊抗人多克隆抗体；选用武汉博士德公司生产的兔抗羊SP试剂盒；选用武汉博士德公司生产的抗羊SABC试剂盒；选用北京中山生物技术开发有限公司生产的二氨基联苯胺(DBA)显色剂。

1.4 实验方法

1.4.1 免疫组织化学法 (1)组织片预处理：脱蜡前，将组织芯片在62℃烤箱内烘烤30 min或过夜。(2)脱蜡：二甲苯Ⅰ：10 min，二甲苯Ⅱ：10 min，(3)再水化：无水乙醇Ⅰ：10 min，无水乙醇Ⅱ：10 min，95%乙醇：5 min，80%乙醇：5 min。(4)三蒸水浸泡清洗，除去酒精，5 min×2次。(5)提前配置pH 6.0的柠檬酸钠修复液，在高压锅中加热至沸腾。将组织芯片插在耐高温塑料切片架上，放置在高压锅里，盖上锅盖及压力阀，待压力上升开始喷气后，计时2 min后，将压力锅移开热源，自然冷却至室温。(6)冷却后取出芯片，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5 min×2次。(7)3%的H2O2封闭10 min(用甲醇配制，现用现配)。(8)PBS冲洗5 min×2次后，正常兔血清封闭20 min，滤纸吸干；勿洗。(9)用PBS稀释抗体(SOX2，1:200)，湿盒加适量一抗，4℃过夜。(10)室温平衡30 min，PBS冲洗5 min×3次。(11)湿盒内滴加生物素标记二抗(即SABC试剂盒中B液)，室温放置20 min。(12)PBS冲洗5 min×3次后，湿盒内滴加C液，室温放置20 min，PBS冲洗5 min×3次。(13)DAB显色(取1 mL蒸馏水，滴加DAB试剂盒中A，B，C试剂盒1滴，混匀后使用)室温显色，显微镜下控制反应时间，反应成功后自来水下冲洗。(14)苏木素复染核4 min后，盐酸乙醇分化20 s，自来水下冲洗干净。(15)PBS反蓝3 min。(16)梯度酒精(脱水)，步骤为75%酒精，5 min；80%酒精，5 min；95%酒精，5 min；100%酒精，5 min；100%酒精，5 min；二甲苯(透明)，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min。(17)中心树胶封片后，显微镜下图像采集。阴性对照：以未免疫的山羊血清代替一抗，染色与上述免疫组化步骤同步进行，观察和对照切片的染色结果。

1.4.2 逆转录PCR(RT-PCR) 参照NCBI上GenBank中发表的人SOX2基因序列，用Primer5软件设计PCR引物,由金斯瑞生物科技公司合成(GAPDH作为内源性参照)。Trizol法提取总RNA，反转录合成cDNA，荧光定量PCR扩增，电泳，根据PCR扩增曲线判读结果。

1.5 免疫组化的结果判定标准 SOX2染色阳性细胞为细胞核呈棕黄色着色细胞，否则为阴性。阳性表达率计算：3个独立观察者分别选取5个高倍镜下独立视野，计算出阳性细胞数及所有细胞数，阳性表达率(%)=(SOX2表达阳性的肿瘤细胞数/所有肿瘤细胞数)×100%，按阳性表达率定义SOX2表达分级：0:＜10%，1+：10%～25%，2+：26%～50%，3+：51%～75%，4+：＞76%，表达分级为(1+)～(4+)的均为阳性表达，表达分级为0的病例为阴性表达。

1.6 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，不同组间阳性率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组标本的SOX2蛋白表达水平比较 SOX2蛋白在正常宫颈组织中不表达，在宫颈癌组织中高表达，见图1。宫颈癌组标本SOX2蛋白表达阳性率为62.07%，明显高于对照组的6.90%，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

图1 宫颈癌组与对照组标本SOX2蛋白表达(×40)

表1 两组标本中SOX2蛋白表达比较[例(%)]

2.2 两组标本中SOX2 mRNA表达水平比较 宫颈癌组标本中SOX2 mRNA表达水平为(14.28±3.41)，明显高于对照组的(1.32±0.61)，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。

2.3 SOX2蛋白表达与宫颈癌患者临床特征关系 SOX2蛋白表达在不同年龄(≥60岁与＜60岁)、不同病理类型(鳞癌、腺癌)、不同FIGO临床分期中表达阳性率比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；SOX2蛋白表达阳性率在高分化与低、中分化的宫颈癌标本之间表达阳性率比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 SOX2蛋白表达与宫颈癌临床特征关系[例(%)]

3 讨论

SOX2位于3号染色体长臂2区6带3亚带(3q26.3)，是SOX家族中具有代表性的一个因子，其最早发现于小鼠胚胎内细胞群干细胞内，在发育过程中的许多阶段和神经组织中均有表达[3]，并被发现具有许多发育调节基因的转录激活因子作用[4-5]。随后的研究显示SOX2可发育成胚胎外胚层的滋养层干细胞。由此可见，在胚胎的发育过程中，SOX2只表达在全能或多能干细胞中，并在胚胎干细胞的自我更新及未分化状态的维持中发挥着关键的作用。SOX2表达具有干细胞特性，一旦细胞出现分化倾向，其表达水平将逐步降低，直至消失[6]，SOX2的失活也会导致植入后胚胎的死亡[7]，这补充了在胚胎形成过程中SOX2是必须的关键因子的争论。SOX2基因可与含POU域的OCT3/4蛋白相互作用，直接激活胚胎干细胞相关基因，并可与OCT3/4蛋白及RAX启动子上游的一个保守非编码DNA形成复合体，最终激活细胞转录功能[8]。此外，SOX2功能主要与神经发生、形成软骨以及决定性别等有关，其对哺乳动物正常发育，尤其是神经系统、造血系统的正常发育存在重要影响。SOX2的缺失可导致哺乳动物出现发育异常或相关先天性疾病，如无眼、小眼、食管闭锁、身材矮小、神经性听力丧失等中枢神经系统疾病。

SOX2与人类的恶性肿瘤有关，在肿瘤组织中高表达，如小细胞肺癌和基底细胞乳腺癌[9-10]。SOX2在未分化的胚胎癌细胞高表达，但是在胚胎癌细胞分化以后却检测不出SOX2 mRNA的表达[5，11]，这就提示SOX2与胚胎癌细胞未分化状态的保持相关。有研究表明，SOX2在乳腺癌组织呈高表达状态，且体外细胞培养实验证实SOX2在促进乳腺癌细胞增殖，加速肿瘤发展中具有显著作用[12]。动物实验表明，SOX2基因通过加速细胞增殖分化参与肿瘤的发生、发展[13]。实验室检测显示降低SOX2在小鼠体内的表达水平后，小鼠基底细胞比例将随之下降[14]。细胞培养实验显示，SOX2高表达可刺激细胞迁移及黏附独立生长，但若敲除SOX2基因，细胞增殖能力将大幅降低。还有研究表明，高表达SOX2的非致瘤性人肺支气管上皮细胞对免疫缺陷大鼠具有致瘤作用，这些均表明SOX2是与干细胞相关的重要调节基因，同时也是癌基因的一种[15]，促进了肿瘤的发生、发展。

本研究中，笔者发现宫颈癌组标本的SOX2蛋白阳性率62.07%显著高于对照组的6.90%，宫颈癌组标本中SOX2 mRNA表达水平为(14.28±3.41)，明显高于对照组(1.32±0.61)，表明SOX2可能是宫颈癌发生、发展中的重要因子。我们还发现SOX2蛋白表达水平与宫颈癌患者年龄、病理类型、FIGO临床分期均无明显相关性，提示SOX2蛋白虽可用于宫颈癌的诊断，但在病理分型、临床分期上无诊断意义。笔者研究也发现SOX2蛋白表达阳性率在高分化与低、中分化的宫颈癌标本之间的差异具有统计学意义，这可能与SOX2对维持癌细胞的未分化状态有关，当癌细胞分化以后，其表达水平逐步降低直至消失。SOX2蛋白在低、中分化宫颈癌标本中的表达率高，表明其多能性细胞比例越高，其自我更新、增殖能力更强，临床恶性度更高。

综上所述，肿瘤干细胞相关基因SOX2在宫颈癌组织中的表达明显高于正常宫颈组织，其表达水平与宫颈癌患者年龄、病理类型、FIGO临床分期无关，但与肿瘤分化程度呈负相关。关于SOX2在宫颈癌发生中的具体机制，其能否作为临床治疗的一个新靶点，还有待进一步研究。

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Expression of SOX2 in cervical cancer and clinical significance.

ZHAO Zong-xia1,CHEN Qing2,WANG Zhi-rong3, XIANG Meng4,LI Fen-xia1,LIANG Wan-qi1,JIA Qiu-ping1,ZHANG Mei1.1.Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Hospitial Affiliated to Xi'an Medical University,Xi'an 710038,Shaanxi,CHINA;2.Department of Obstetrics and Gynecology,the Second Hospital Affiliated to Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710005,Shaanxi,CHINA;3.Department of Gynecology,the Hospital of Northwestern Polytechnical University,Xi'an 710072,Shaanxi,CHINA;4.Teaching and Researching Office of Obstetrics and Gynecology,Department of Clinical Medicine,Xi'an Medical University,Xi'an 710021, Shaanxi,CHINA

Objective To study the expression of cancer stem cell related gene SOX2 in cervical carcinoma and its clinical significance.MethodsThe cervical tissue specimens of 58 cases of women with cervical cancer,who admitted to Department of Obstetrics and Gynecology of the Second Hospital Affiliated to Xi'an Medical University from January 2012 to June 2015,were selected as the objects of study(cervical cancer).At the same time,the normal cervical tissue of the same patients were chosen as the control group.The difference of SOX2 expression in two groups was detected.ResultsSOX2 protein positive rate of the cervical cancer tissue specimens was significantly higher thanthat of the control group,62.07%(36/58)vs 6.90%(4/58),P＜0.05.The expression of SOX2 mRNA in the cervical cancer tissue specimens(14.28±3.41)was significantly higher than that of in the normal cervical tissue(1.32±0.61),P＜0.01.The SOX2 protein positive rate of in high differentiated cervical cancer tissue specimens was significantly lower than that in the medium and low differentiated cervical cancer tissue specimens,34.29%(12/35)vs 82.61%(19/23),P＜0.05.The expression of SOX2 protein has no statistically difference at different age(≥60 years and＜60 years),different pathological types(squamous cell carcinoma and adenocarcinoma),and FIGO different clinical stage(P＞0.05).ConclusionThe expression of SOX2 in cervical cancer tissue specimens is significantly higher than normal cervical tissue,and negatively related to the differentiation of the tumor.

SOX2;Cervical cancer;Tumor differentiation;Clinical significance

R-332

A

1003—6350（2016）18—2939—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.18.006

2016-04-13)

陕西省教育厅自然科学基金(编号：2013JK0797)

张美。E-mail：zhangmei509@163.com