应用微阵列比较基因组杂交技术对胎儿额外小标记染色体及染色体大片段重复进行产前诊断

江　均，　梁　华

1湖北省红安县妇幼保健院妇产科，红安　438400

2武汉大学人民医院妇产科，武汉　430060



应用微阵列比较基因组杂交技术对胎儿额外小标记染色体及染色体大片段重复进行产前诊断

江均1，梁华2

1湖北省红安县妇幼保健院妇产科，红安438400

2武汉大学人民医院妇产科，武汉430060

摘要：目的对产前羊水细胞培养染色体核型分析，检测出来源不明染色体片段的胎儿应用基于芯片的微阵列比较基因组杂交(aCGH)技术检测，以明确其遗传物质的变异，探讨aCGH技术在检测胎儿来源不明染色体片段致病性中的临床价值。方法通过胎儿羊水细胞培养，染色体G显带核型分析，诊断出2例胎儿染色体异常(来源不明片段)，核型分别为47，XY，+Mar及46，XY，add(16)(p13.1)。对此2例标本进行aCGH分析，通过多位点高分辨率扫描确定未知片段的来源及大小。结果aCGH扫描检测出其中一个胎儿染色体在15q11.1-q12.1区带存在3.2 Mb的重复，另一个胎儿染色体在13q22.2-q33.3区带存在35.1 Mb的重复。结论利用aCGH技术可以方便快速地鉴定和分析染色体的重复变异，也能高效地对染色体重复片段进行定位，结合传统的核型分析技术，可以为判断额外染色体片段的遗传学效应和产前诊断提供帮助。

关键词：微阵列比较基因组杂交技术；额外小标记染色体；染色体片段重复；产前诊断

基因组拷贝数变化(copy number variations，CNVs)即染色体片段的重复或缺失，指与参考基因组相比，拷贝数存在差异且增加或减少的碱基数目>1 kb，这是一种十分普遍的染色体变异，并且很多染色体数目的变异都与疾病直接相关[1]。最近的研究表明，CNVs在人类疾病的病因学中具有重要作用，尤其是罕见的变异[2]。对于基因组拷贝数变化，在细胞、亚细胞水平主要表现为染色体片段的缺失或重复。具体表现有染色体缺失、染色体重复、染色体缺失和重复并存及额外小标记染色体(small supernumerary marker chromosome，sSMC)等。许多细胞遗传学技术，如染色体核型分析技术、荧光原位杂交(FISH)和比较基因组杂交(CGH)等都能用于CNVs的检测，但这些技术因其自身的局限，限制了其在临床上的应用。由于传统的细胞遗传学技术(核型分析、FISH及CGH等)存在以上缺陷，已经无法满足快速的数据产出和分析的需要，发展新的高效的检测技术十分必要，近年来兴起的微阵列比较基因组杂交(array comparative genome hybridization，aCGH)技术就是应用于这方面的一项新技术。本研究应用微阵列比较基因组杂交和细胞培养核型分析技术，成功对2例羊水细胞来源的染色体异常进行了产前诊断。

1对象与方法

1.1研究对象

孕妇1：27岁，因孕19周，产前无创胎儿DNA筛查高风险(1：20)，在我院做羊水穿刺检查，抽取羊水送至武汉大学人民医院，通过细胞培养，G显带染色体核型分析发现有额外小标记染色体。

孕妇2：36岁，因孕21周，超声提示：双侧脑室异常回声，单脐动脉，左右心室强光斑等异常，在我院做羊水穿刺检查，抽取羊水送至武汉大学人民医院，通过细胞培养，G显带染色体核型分析发现有额外染色体片段。

因光镜下核型分析技术无法确定额外小标记染色体和额外染色体片段的来源，于是查两对夫妻双方外周血染色体，均为正常结果，排除夫妻为染色体平衡易位携带者的可能性。为确定胎儿额外小标记染色体和额外染色体片段的来源，进一步进行胎儿羊水细胞微阵列比较基因组杂交检查。

1.2羊水采集及全基因组DNA提取

经孕妇及家属知情同意，在无菌条件下，经超声引导，用一次性羊水穿刺针经腹抽取羊水5 mL，置于无菌离心管中。根据羊水基因组DNA提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)说明书抽提基因组DNA并测定DNA浓度和纯度。

1.3aCGH检测

采用北京博尔诚(Bio Chain)公司基于安捷伦(Agilent)aCGH微阵列芯片的分析检测平台，对2份样本进行比较基因组学杂交，该芯片分辨率为50 K，探针数目6万，利用安捷伦Gnomic Workbench软件进行结果分析。

2结果

胎儿1：G显带染色体核型分析提示，胎儿染色体中有额外小标记染色体(sSMC)，具体核型为47，XY，+Mar(图1)。

羊水细胞DNA aCGH检测提示：胎儿染色体在15q11.1-q12.1区带存在大小为3.2 Mb重复，CNV数据库显示此区段重复为正常人染色体多态性(图2)。

核型为47，XY，+Mar，箭头所示为额外小标记染色体图1　胎儿1羊水细胞染色体核型分析Fig.1 Karyotype analysis of amniocytes in fetal 1

因油镜(放大1 000倍)下可见的染色体片段肯定大于3.2 Mb，据此我们推断此Marker染色体除了一部分来源于常染色质区(15号染色体长臂q11.1-q12.1)，另一部分来自于芯片探针未覆盖的异染色质区。

来自异染色质区的Marker染色体通常是不致病的(因异染色质区通常不含重要的功能基因和调控基因)，而常染色质区15q11.1-q12.1的重复也是正常人染色体的多态性，结合核型分析结果和各项产检结果(彩超，磁共振等)，我们判断：此胎儿的遗传物质无致病性异常，我们给出了不建议引产的结论。

胎儿2：G显带染色体核型分析提示，胎儿染色体中有额外染色体片段，具体核型为46，XY，add(16)(p13.1)(图3)。

羊水细胞DNA aCGH检测提示：胎儿染色体在13q22.2-q33.3区带存在大小为35.1 Mb的重复(图4)，CNV数据库显示此区段包含大量功能基因。该区域重复为临床致病性拷贝数改变，可导致13号染色体部分三体征，可表现为前脑无裂畸形、膈疝、腭裂、多发畸形、特殊面容、神经系统发育异常、智力低下、运动、语言发育迟缓，自闭症等[3]。

由于aCGH检测结果显示胎儿的染色体有致病性改变，结合之前超声检查的异常发现，我们判定该胎儿出生后患相关疾病的风险极大，预后差。向家属解释交代相关病情后，家属要求引产，引产出1例男性死婴，尸体病检显示，前脑无裂畸形，单脐动脉。

arr 15q11.1-q12.1(20 481 702-23 689 254)×3(红色区域表示存在DNA重复，绿色区域表示存在DNA缺失)图2　胎儿1 aCGH检测结果Fig.2 aCGH analysis of fetal 1

核型为46，XY，add(16)(p13.1)，箭头所示为衍生染色体图3　胎儿2羊水细胞染色体核型分析Fig.3 Karyotype analysis of amniocytes in fetal 2

3讨论

在产前检查的过程中，对于常规产检，唐氏筛查，超声检查等发现的可疑征象，往往需要进行细胞和分子层面的更为准确精细的检测。临床上常用的手段有细胞培养染色体核型分析、FISH、CGH等，通过细胞培养染色体核型分析技术可以发现的基因组拷贝数变化主要表现形式为较大片段的染色体缺失或重复。染色体缺失(或重复)可表现为染色体片段缺失(或重复)以及整条染色体缺失(或重复)。染色体片段缺失(或重复)的个体可为新发突变，也可能是平衡易位携带者产生的遗传物质不平衡的后代。整条染色体缺失(或重复)即染色体数目异常，常见的核型有47，XN，+21，45，XO等。染色体缺失和重复并存的个体多为平衡易位携带者产生的遗传物质不平衡的后代。

额外小标记染色体(sSMC)是指通过常规细胞培养，染色体核型分析技术可以在光镜下辨认但无法确定结构和来源，大小通常等于或小于同一分裂相20号染色体的染色体片段。在胎儿中，sSMC的发生率为0.075%。sSMC的表型效应，取决于它的来源，片段大小，以及是否含有重要的功能基因和调控基因等[4]。染色体核型分析技术由于分辨率低，难以检测亚显微的CNVs；对于检测出的染色体异常，染色体缺失可以通过核型分析技术确定缺失区域的大小和区带，但对于染色体重复和sSMC，核型分析技术则难以确定大小、来源或断裂点，故对临床帮助有限，有时还需查父母双方染色体，无形中增加了患者的心理和经济负担。FISH技术则因探针和检测位点的限制，在临床应用范围也不大。CGH由于通量低、杂交区域数太少、灵敏度不够，仅能对有限的基因组位点进行分析，无法对整个基因组进行筛查，故未能在临床实际应用。这些技术对染色体大片段的缺失或重复等变异能识别其存在，但很难识别片段来源，无法进行全基因组的筛查，往往不能明确染色体变异对表型带来的影响，所以必须依靠其他分子遗传学手段以明确诊断，近年来新发展起来的分子诊断技术有多重连接介导的探针扩增技术(MLPA)、光谱核型分析技术(spectral karotyping，SKY)、aCGH技术、基因测序技术等[5-7]。随着DNA微阵列平台(DNA microarray platform)的出现及改进以及计算机科学和光电化学的进步，微阵列比较基因组杂交(aCGH)作为一种新型的强大的细胞遗传分析方法，为细胞遗传诊断和研究提供了一个新的平台。aCGH技术是将芯片技术和传统的CGH技术相结合的产物，弥补了传统的CGH技术在分辨率以及通量等方面的不足，可以对染色体变异进行更为详细的检测，在整个基因组范围内检测出染色体不平衡，包括染色体非整倍体、微缺失和微重复。aCGH分辨率可达50 K，而CGH技术和染色体核型分析技术最大分辨率为5~10 Mb，aCGH比后两种技术灵敏度提高了100倍。aCGH能把成千上万个分散的位点整合在一张可以同时分析的微阵列芯片上，相当于同时进行了数万个独立的FISH[8]，并可将变异直接定位到基因组上。aCGH技术，将CNVs的检测分析成功推广到了临床。

arr 13q22.2-q34(76 432 267-111 946 264)×3(红色区域表示存在DNA重复，绿色区域表示存在DNA缺失)图4　胎儿2 aCGH检测结果Fig.4 aCGH analysis of fetal 2

目前在产前筛查和产前诊断方面，常用的方法有唐氏筛查、影像学检查(超声或磁共振)、母体外周血分离胎儿游离DNA检查(无创产前筛查，简称无创)、羊水(或脐带血)细胞培养染色体核型分析和FISH等。其中羊水(或脐带血)细胞培养染色体核型分析是传统方法，被称为产前诊断的“金标准”，较之染色体核型分析，aCGH方法的优势在于分辨率高和报告周期短。由于aCGH技术无需细胞培养，故没有培养过程中的污染和培养可能导致的突变的隐患。FISH技术也无需培养，近年来在临床上也有较大推广，但FISH一次只能检测13、18、21、X和Y等少数几条染色体的数目异常，其检测范围和aCGH技术差了4个数量级。无创技术因其无穿刺风险，痛苦小，最近几年发展迅猛。但归根结底，无创只能作为一种筛查手段，而不是产前诊断技术，且无创技术只对13、18和21号染色体的数目异常有较高的筛查准确率。较之无创技术，aCGH技术是一种产前诊断技术，而且可以检测全基因组范围的变异。可以预计在产前诊断领域，aCGH技术将成为确定染色体异常首选的诊断方法，因为它对于遗传物质有不平衡改变的患者有非常高的检出率[9]。本文中，我们应用aCGH技术对额外小标记染色体及染色体大片段重复检测，主要目的是分辨这些CNVs是单纯多态性还是致病性的[10]。人类基因组中拷贝数的复制或丢失十分常见。基于aCGH的高分辨率，越来越多的CNVs将被发现，在产前诊断的过程中，我们要分辨这些CNVs是否具有致病性。在既往的产前诊断中，对CNVs胎儿的预后评估比较困难，其结果常导致不适当的终止妊娠[11]。对于例1诊断出的染色体重复，通过对Genomic Variants数据库的查询得知，该区段的重复一部分是正常人染色体的多态性，另一部分为异染色质区域。结合各项产检结果，我们得出的判断是：此胎儿的遗产物质无致病性异常，出生后表型应无异常。现该幼儿已满1岁，在我院各项体检结果均未见异常。目前，新一代的aCGH芯片，已有针对异染色质区域的探针，若用这类芯片，还可以查明本例额外小标记染色体中异染色质片段的来源，做出更准确全面的诊断。对于例2，通过对Genomic Variants数据库的查询得知，该区域重复为临床致病性拷贝数改变，可导致严重畸形。结合之前超声检查的异常结果，我们判定该胎儿出生后患相关疾病的风险极大，预后差，之后的尸体病检也证实了我们的诊断。

aCGH技术作为一种新兴的染色体核型分析技术，能够满足临床的要求，在产前诊断上具有重要的应用价值，其不仅可以诊断出传统技术由于分辨率、灵敏度不够而无法检测的变异，还能更加方便、快速、准确地检测出染色体较大片段重复或缺失的变异，并能快速地鉴定出变异的来源，阐明染色体变异对出生后表型的影响，将aCGH技术应用于产前诊断，可使疾病检出率较大幅度地提高[12-13]。在aCGH技术应用于临床之前，对于羊水细胞染色体核型分析发现异常的胎儿，临床医生往往会建议终止妊娠。对于唐氏综合征等染色体异常，终止妊娠是不存在争议的；但是对于某些额外小标记染色体及染色体大片段重复或缺失(比如本文的2例)，染色体易位、倒位等，因难以确定其来源和对表型的影响，往往需查父母双方染色体，加做C显带，N显带或FISH等检查，若还不能确定来源，终止妊娠就成为规避可能存在风险的无奈之选。现在，随着aCGH技术在临床的推广，对于来源不明的染色体片段，我们可以确定其来源和对表型的影响，这就减少了一些不必要的终止妊娠，为一些家庭减少了精神痛苦和经济负担。当然，在另一方面，这也对相关医务工作者在实验诊断和结果分析、判读上提出了更高的要求。

综上所述，传统的细胞遗传学技术(细胞培养、核型分析)及FISH技术已不能满足日益复杂的患者检测的需要，新近发展的分子技术(aCGH等)在诊断CNVs(额外小标记染色体及染色体大片段重复等)病例上具有快速、简便、准确的特点，为遗传优生咨询和产前诊断提供了有力的支持。

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(2015-10-22收稿)

Application of Array Comparative Genome Hybridization Technology to Prenatal Diagnosis of Small Supernumerary Marker Chromosome and Chromosome Fragment Repetition

Jiang Jun1，Liang Hua2

1DepartmentofObstetricsandGynecology，MaternalandChildHealthCareHospitalofHong’anCounty，Hong’an438400，China2DepartmentofObstetricsandGynecology，People’sHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China

AbstractObjectiveTo explore the clinical application of array comparative genomic hybridization(aCGH)and karyotype analysis in the prenatal evaluation of fetal with small supernumerary marker chromosome(sSMC)and large chromosome fragment repetition.MethodsTwo fetuses were diagnosed as having abnormal chromosomes by G-banding analysis of amniocytes.One fetus had a karyotype of 47，XY，+Mar，and the other had a karyotype of 46，XY，add(16)(p13.1).aCGH was used to examine the precise location and size of the unknown chromosome fragment by multi-site high resolution scanning.ResultsaCGH revealed that there was 3.2 Mb duplication in 15q11.1-q12.1 in the first fetus，35.1 Mb duplication in 13q22.2-q33.3 in the second fetus.ConclusionThe technology of aCGH can be used for convenient and rapid identification and analysis of chromosome fragment repetition，and also for locating the loci of the chromosome fragment repetition.Combined with the karyotype analysis，it can be applied to genetics analysis and prenatal diagnosis.

Key wordsaCGH technology；small supernumerary marker chromosome；chromosome fragment repetition；prenatal diagnosis

中图分类号：R714.15

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.023

(2015-11-12收稿)

江均，男，1982年生，主治医师，E-mail：jun3089@qq.com