胡椒碱抑制脂多糖活化的结肠腺癌细胞炎症因子IL-8的表达

刘　冲，　赵家敏，　杨龙君，　张　力

1山东省潍坊医学院附属医院胃肠外科，潍坊　261031

2中国人民解放军第八十九医院泌尿外科，潍坊　261021



胡椒碱抑制脂多糖活化的结肠腺癌细胞炎症因子IL-8的表达

刘冲1，赵家敏2，杨龙君1，张力1

1山东省潍坊医学院附属医院胃肠外科，潍坊261031

2中国人民解放军第八十九医院泌尿外科，潍坊261021

摘要：目的探讨胡椒碱抑制脂多糖(LPS)活化的结肠腺癌细胞炎症因子IL-8的表达及作用机制。方法胡椒碱对结肠腺癌细胞增殖作用的检测方法为WST-1法，采用流式微球捕获蛋白定量技术检测炎症因子(IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和IL-12p70)蛋白水平的表达，采用实时定量PCR法检测IL-8 mRNA的表达，采用Western blot法检测JNK和p38MAPK信号通路的活化水平。结果胡椒碱处理可剂量依赖性地抑制结肠腺癌细胞的增殖，且胡椒碱对结肠腺癌细胞的毒性相对较小；胡椒碱干预能够有效地抑制LPS活化的结肠腺癌细胞IL-8的分泌，且具有剂量依赖性；单纯胡椒碱处理后IL-8 mRNA表达水平非常低，而经过LPS处理后，IL-8 mRNA的表达水平显著提高，LPS干预后再经过胡椒碱处理结肠腺癌细胞IL-8 mRNA的表达水平又降低，表明胡椒碱对LPS活化的结肠腺癌细胞IL-8蛋白的表达是在转录水平控制的；LPS干预结肠腺癌细胞能有效地激活p38和JNK信号通路，且随着时间的延长，p-p38及p-JNK逐渐增高，具有时间依赖性，而LPS干预后经过胡椒碱处理，15 min后p38及JNK的磷酸化水平明显受到抑制，与单纯LPS干预组相比差异有统计学意义(P<0.05)，随着时间的推移，30 min时，p38和JNK的磷酸化抑制作用仍较显著(均P<0.05)，而到60 min时，p38和JNK的磷酸化抑制作用已经明显减弱(均P>0.05)，说明胡椒碱对p38和JNK的磷酸化具有明显的抑制作用。结论胡椒碱可能从转录水平上抑制LPS诱导的结肠腺癌细胞分泌促炎因子IL-8，即通过下调p38 MAPK和JNK信号通路上p38和JNK的磷酸化进一步降低IL-8的分泌，具体机制还有待于进一步阐明。

关键词：胡椒碱；结肠腺癌细胞；脂多糖；IL-8

胡椒碱是一种广泛存在于自然界中的桂皮酞胺类生物碱，对胃肠疾病有较好的抗炎作用[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是细菌内毒素的主要成分，可以诱导炎症因子(IL-8)等的分泌，造成组织严重损伤[2-3]。LPS刺激人结肠腺癌细胞，是常用的人体肠炎体外细胞模型，能刺激信号传导，本研究探讨胡椒碱对LPS刺激的SW480细胞炎症因子的表达和MAPK信号通路的影响，初步探讨胡椒碱发挥抗炎作用的机制。

1材料与方法

1.1材料

人结肠腺癌细胞株SW480从中科院北京细胞库购买；胡椒碱(含量>99%，熔点75.5~77.5℃)购自宁夏制药厂；LPS、L15培养液、p38、p-p38(磷酸化的p38)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、磷酸化的JNK(p-JNK)和β微管蛋白(β-tubulin)抗体购自Sigma公司；WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自Gibco公司；微量样本多指标流式蛋白定量(Cytometric Beads Array，CBA)试剂盒、人类细胞活素炎症试剂盒(Human inflammation cytokines kit)购自美国BD公司；全蛋白提取试剂盒购自上海碧云天公司；超敏ECL化学发光试剂盒(BeyoECL Plus)购自上海碧云天公司。

1.2SW480细胞培养

将SW480结肠腺癌细胞置于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的L15培养液中，在37 ℃、无CO2培养箱中培养48 h后，取对数生长期细胞进行实验。

1.3WST-1法检测细胞增殖

取对数生长期的细胞接种于96孔板内，每孔接种浓度为每孔100 μL(1×104个细胞)，在37℃，不含有CO2的培养箱中培养1 d后将培养液换成含有胡椒碱的培养液，在培养2 d后，加入WST-1 10 μL继续培养，在波长450 nm下测定吸光度值(A)。空白对照组细胞培养只含有培养液。增殖率=(实验组A450 nm-空白组A450 nm)/(对照组A450 nm-空白组A450 nm)×100%，并绘制细胞增殖曲线，计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.4炎症因子蛋白表达的检测

取对数生长期的细胞接种于24孔板内，每孔500 μL(4×104个细胞)，在37 ℃，不含CO2的培养箱中培养过夜，待其融合贴壁后将细胞分为8组，即空白对照组、不同浓度胡椒碱处理组(胡椒碱浓度分别为10、20、40 μmol/L)、LPS干预组(LPS终浓度为100μg/L)、LPS干预后胡椒碱处理组(在LPS 100 μg/L处理1 h后加入不同浓度胡椒碱，即10、20、40 μmol/L)。培养1 h后收集培养液，根据CBA方法的要求将收集的培养液与捕获微球共孵育后进行流式细胞术检测炎症因子蛋白表达。

1.5qRT-PCR对结肠腺癌细胞IL-8 mRNA表达的检测

取对数生长期细胞接种于6孔板内，每孔600 μL(6×105个细胞)。细胞随机分成4组：空白对照组、胡椒碱处理组(40 μmol/L)、LPS干预组、LPS干预后胡椒碱处理组。空白对照组单纯用培养液对细胞进行孵育，胡椒碱处理组用浓度为40 μmol/L的胡椒碱培养液进行孵育，LPS干预组及LPS干预后胡椒碱处理组分别以浓度为100 μg /L LPS的培养液孵育1 h后，将LPS丢弃，之后分别加入单纯培养液或浓度为40 μmol/L胡椒碱培养液培养，收集各组细胞。根据说明提取细胞总RNA，根据逆转录TaKaRa试剂盒说明书合成cDNA。引物序列如表1所示。

表1　PCR基因引物序列

合成的cDNA用Bio-Rad Chromo4多色实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增。采用2-ΔΔCt法分析基因表达量。

1.6Western blot法检测结肠腺癌细胞p38MAPK、JNK信号通路活化水平

取对数生长期结肠腺癌细胞接种于25 cm2的培养瓶中，每瓶浓度为1.8 ×106，细胞随机分成4组，空白对照组、胡椒碱处理组(40 μmol/L)、LPS干预组、LPS干预后胡椒碱处理组，空白对照组单纯用培养液对细胞进行孵育，胡椒碱处理组用浓度为40 μmol/L的胡椒碱培养液进行孵育，LPS干预组及LPS干预后胡椒碱处理组分别以浓度为100 μg /L LPS的培养液孵育(15、30、60 min)后，将LPS丢弃，之后分别加入单纯培养液或浓度为40 μmol/L胡椒碱培养液继续进行培养，收集各组细胞，按照蛋白提取试剂盒的说明提取蛋白，SDS-PAGE电泳后，进行转膜、封闭液封闭1 h后加入一抗4℃过夜后，PBS洗涤3次后，加入二抗在室温条件下孵育1 h，PBS洗涤3次后，发光剂显色后X线显影，并分析X线结果。

1.7统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1胡椒碱对结肠腺癌细胞增殖的影响

从图1中可以看出胡椒碱对结肠腺癌细胞作用48 h后，对结肠腺癌细胞增殖具有明显的抑制作用，胡椒碱浓度低于50 μmol/L时，对细胞的毒性作用较小，浓度增高时毒性作用增大，其IC50为146.3 μmol/L。在后续实验中选择毒性较小的胡椒碱浓度进行研究。

图1　胡椒碱对结肠腺癌细胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of piperine on the viability of colonic adenocarcinoma cells

2.2胡椒碱对LPS活化的结肠腺癌细胞IL-8蛋白表达的影响

本研究发现无TNF-α、IL-6、IL-10等促炎症因子的分泌，仅仅检测到IL-8的分泌。从表2中可以看出，不同浓度胡椒碱处理组结肠腺癌细胞中IL-8仅有少量表达，与空白对照组相比差异无统计学意义(均P>0.05)；而结肠腺癌细胞经过LPS活化处理后，IL-8的水平明显升高，经过胡椒碱处理后，IL-8的分泌水平逐渐降低，并且与胡椒碱的浓度呈明显的相关性，即胡椒碱浓度升高，抑制程度增强，胡椒碱40 μmol/L时对LPS活化结肠腺癌细胞分泌IL-8的抑制程度最明显，与10 μmol/L胡椒碱处理组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3胡椒碱对LPS活化的结肠腺癌细胞IL-8 mRNA表达的影响

在测定结肠腺癌细胞IL-8蛋白分泌水平的基础上，本研究选择40 μmol/L的胡椒碱剂量测定mRNA水平，空白对照组及单纯胡椒碱处理组IL-8 mRNA表达水平非常低，分别为(0.21±0.11)、(0.35±0.13)；而经过LPS处理后，IL-8 mRNA的表达水平显著提高，为(146.27±25.63)，LPS干预后再经过胡椒碱处理结肠腺癌细胞IL-8 mRNA的表达水平又降低，为(105.57±18.39)，LPS干预组与LPS干预后胡椒碱处理组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。这表明胡椒碱对LPS活化的结肠腺癌细胞IL-8蛋白的表达是在转录水平控制的。

表2　胡椒碱对LPS活化的结肠腺癌细胞IL-8

与空白对照组及不同浓度胡椒碱处理组比较，*P<0.05；与LPS干预组比较，#P<0.05；与LPS干预后10 μmol/L胡椒碱处理组比较，▲P<0.05

2.4胡椒碱对MAPK信号通路的影响

p38和JNK信号通路在MAPK家族中占有重要的地位，p-p38及p-JNK分别是p38和JNK的磷酸化状态，代表p38及JNK信号通路的活化程度。从图2及表3中可以看出，LPS干预结肠腺癌细胞能有效地激活p38和JNK信号通路，且随着时间的延长，p-p38及p-JNK逐渐增高，具有时间依赖性，而LPS干预后经过胡椒碱处理，15 min后p38及JNK的磷酸化水平明显受到抑制，与单纯LPS干预组相比差异具有统计学意义(均P<0.05)，随着时间的推移，30 min时，p38和JNK的磷酸化的抑制作用仍较显著(均P<0.05)，而到60 min时，p38和JNK的磷酸化的抑制作用已经明显减弱，相比差异无统计学意义(均P>0.05)，说明胡椒碱对p38和JNK的磷酸化具有明显的抑制作用，且有效地降低p38MAPK和JNK信号通路的活化水平。

图2　胡椒碱对p38及JNK信号通路活化的影响Fig.2 Effect of piperine on the activation of p38 and JNK signaling pathways

组别处理时间(min)p-p38/p38p-JNK/JNKLPS干预组(100μg/L)00.63±0.131.31±0.12151.36±0.062.24±0.03301.77±0.052.99±0.26602.18±0.113.83±0.13LPS干预后胡椒碱处理组(μmol/L)00.26±0.011.28±0.12151.16±0.17*1.83±0.16*301.53±0.18*2.38±0.25*602.03±0.143.53±0.03

与相同时间点LPS干预组比较，*P<0.05

3讨论

胡椒广泛存在于治疗胃肠炎的传统中药配方中。药理学研究显示，胡椒碱是胡椒的重要活性成分，发挥着重要的生物学作用，首先，胡椒碱能够有效地提高胃肠道的吸收功能，达到保护胃肠道，防止腹泻的目的[1]；其次是具有抗氧化及抗炎的作用，对胃溃疡、关节炎及急性胰腺炎有较好的治疗作用[4-6]，能够有效地抑制炎症因子的产生[7]；再次是抗抑郁症和抗癫痫作用[8-9]；最后在各种药物的配比中，胡椒碱是一种药物佐剂，能够有效地提高药物的利用度[10-11]。胡椒碱虽然有较强的抗炎作用，但具体机制尚不清楚。

在中药的健胃消食配方中，胡椒是重要的组成部分，也是健胃食谱的重要成分，但胡椒碱健胃的分子机制尚不明了。本实验采用LPS刺激SW480结肠腺癌细胞，从而模拟人体内的肠道炎症环境，通过胡椒碱处理，探讨胡椒碱对肠道炎症的抗炎作用。结果显示，LPS能够有效地激活结肠腺癌细胞分泌促炎因子IL-8，通过胡椒碱处理后IL-8的分泌显著受抑制，说明胡椒碱对肠炎有一定的抑制作用。

肠炎是肠道炎症的总称，主要发生在直肠、结肠或回肠，主要症状为腹泻、腹痛、肠道溃疡等。根据肠道炎症的程度不同，轻度的一般进行饮食调整、补充充分的维生素及营养治疗，中重度的肠道炎症多采用药物治疗，一般用糖皮质激素抗炎、氨基水杨酸制剂止痛及免疫抑制剂抑制免疫反应等治疗，若重度炎症造成肠道脓肿、肠梗阻、大出血及穿孔等，多采取手术治疗[12]。肠道炎症容易复发，最终导致结直肠癌的发生[13]。

促炎症因子的过量分泌造成了肠道慢性炎症的发生，IL-8是重要的促炎症因子之一。发生肠道炎症反应时，很多细胞包括上皮细胞及单核细胞均能分泌促炎性因子IL-8[14]，另外，IL-8还具有有效激活及趋化中性粒细胞的作用，进而有效促进中性粒细胞分泌其它促炎因子，如TNF-α、IL-6、IL-10，等[15]。本研究通过CBA法检测LPS诱导下SW480结肠腺癌细胞发现无TNF-α、IL-6、IL-10等促炎症因子的分泌，仅仅检测到IL-8的分泌。进一步的研究结果显示，胡椒碱能够有效地抑制LPS诱导的SW480结肠腺癌中IL-8的分泌，而且IL-8 mRNA的水平明显下调，说明胡椒碱是从转录水平上抑制IL-8在结肠腺癌细胞中的分泌。

近年来，有学者研究[16]表明，IL-8 mRNA的合成必须要有3个不同的信号通路共同协同，解除对IL-8的去抑制作用后，JNK、NF-κB及p38MAPK 三条信号通路被激活，使IL-8 mRNA的转录作用激活并稳定。

LPS是细菌内毒素的主要成分，可以与Toll样受体4进行结合，LPS与Toll样受体结合后能够有效地刺激NF-κB和MAPK信号通路最终激活IL-8 mRNA的转录。p38MAPK信号通路激活后，通过ARE靶点增强IL-8 mRNA的稳定性，促进IL-8蛋白的分泌。p38MAPK和JNK信号通路协同参与了多种疾病的细胞凋亡及免疫反应等病理生理过程[17]。本研究对LPS活化的结肠腺癌细胞炎症因子IL-8表达进行研究，结果显示胡椒碱能够有效地抑制LPS处理的JNK和p38的磷酸化，说明胡椒碱能够下调MAPK信号通路，从而抑制IL-8的分泌，达到抗炎作用。

胡椒碱是从食物胡椒中提取出来的一种成分，对结肠腺癌细胞的毒性作用相对较小，当胡椒碱浓度高于100 μmol/L时，能够有效地抑制结肠腺癌细胞的增殖作用。有文献[18]报道，胡椒碱能够诱发肿瘤细胞发生凋亡；另有学者[19]研究表明，胡椒碱能够有效抑制前列腺癌肿瘤细胞周期阻滞，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

总之，胡椒碱可能从转录水平上抑制LPS诱导的结肠腺癌细胞分泌促炎因子IL-8，即通过下调p38MAPK和JNK信号通路上p38和JNK的磷酸化进一步降低IL-8的分泌，具体机制还有待于进一步阐明。

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(2015-10-07收稿)--------------------------------------------------------------------------------------------

Piperine Inhibits the Expression of IL-8 in LPS-stimulated Colon Adenocarcinoma Cells

Liu Chong1，Zhao Jiamin2，Yang Longjun1etal

1DepartmentofGastrointestinalSurgery，TheAffiliatedHospitalofWeifangMedicalCollege，Weifang261031，China2DepartmentofUrology，The89thHospitalofPeople’sLiberationArmy，Weifang261021，China

AbstractObjectiveTo explore the inhibitory effect of piperine on the expression of the inflammatory cytokine IL-8 in lipopolysaccharide(LPS)-induced colon adenocarcinoma cells and the underlying mechanism.MethodsThe effect of piperine on the proliferation of colon adenocarcinoma cells was examined by WST-1 assay.The expression levels of inflammatory cytokines(IL-8，IL-1β，IL-6，IL-10，TNF-α and IL-12p70)were detected by cytometric beads array，and the IL-8 mRNA levels by real-time quantitative PCR.The activation of p38 and JNK pathways was determined by Western blotting.ResultsPiperine with little toxicity could dose-dependently inhibit the proliferation of colon adenocarcinoma cells.It could effectively suppress the secretion of IL-8 protein from LPS-stimulated colon adenocarcinoma cells in a dose-dependent manner.Moreover，piperine pretreatment could significantly depress the IL-8 mRNA expression in LPS-induced colon adenocarcinoma cells，suggesting that piperine inhibited IL-8 expression at the transcription level in LPS-induced cells.LPS intervention could significantly activate the p38 and JNK signaling pathways in a time-dependent manner.Piperine treatment after LPS intervention could obviously decrease the phosphorylated levels of p38 and JNK at 15 and 30 min.And the effect was not significant at 60 min.It was suggested that piperine had significant inhibitory effects on the phosphorylation of p38 and JNK.ConclusionPiperine may inhibit the secretion of the proinflammatory factor IL-8 at transcription level in LPS-induced colon adenocarcinoma cells by suppressing the phosphorylation of p38 and JNK in p38MAPK and JNK signaling pathways.The specific mechanism remains to be further elucidated.

Key wordspiperine；colon adenocarcinoma cells；LPS；IL-8

中图分类号：R573

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.014

刘冲，男，1981年生，主治医师，E-mail：lchong951@163.com