改良的猪胰弹性蛋白酶气压灌注法建立小鼠实验性腹主动脉瘤模型*

魏战杰，　王淑霞，　杨　勇，　刘　坤，　廖耀行，　杨传蕾，　刘金平△

华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院1普外科3放射科，武汉　430014

华中科技大学同济医学院附属协和医院2心血管外科4心血管内科，武汉　430022



实验研究

改良的猪胰弹性蛋白酶气压灌注法建立小鼠实验性腹主动脉瘤模型*

魏战杰1，2，王淑霞3，杨勇4，刘坤4，廖耀行2，杨传蕾2，刘金平2△

华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院1普外科3放射科，武汉430014

华中科技大学同济医学院附属协和医院2心血管外科4心血管内科，武汉430022

摘要：目的探讨用一种新型的猪胰弹性蛋白酶气压灌注法建立小鼠实验性腹主动脉瘤模型。方法40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为常规模型组(n=15)，改良模型组(n=15)，改良对照组(n=10)。常规模型组使用猪胰弹性蛋白酶利用水压逆行灌注腹主动脉5 min，改良模型组使用猪胰弹性蛋白酶利用气压顺行灌注腹主动脉5 min，而改良对照组使用生理盐水气压下顺行灌注5 min，14 d后，收取腹主动脉标本，测量血管直径，并行EVG染色，进行统计学及组织学评估。结果与常规模型组相比，改良模型组的成瘤率明显增高(P<0.05)，血管直径也明显增大[(1.765±0.095)vs. (1.440±0.091) mm，P<0.05]，而实验鼠存活率亦明显升高(100%vs. 80%)。改良模型组EVG染色显示弹力纤维断裂、降解，符合动脉瘤的病理学特征。结论通过改良设计的新型猪胰弹性蛋白酶气压灌注法高效建立了小鼠腹主动脉瘤模型。

关键词：猪胰弹性蛋白酶；小鼠；腹主动脉瘤模型

腹主动脉瘤(AAA)是一种严重威胁患者生命的危重血管疾病，具有明显的年龄、性别相关性[1]。然而目前临床上并无有效的药物治疗可以抑制AAA的发展[2]，因此AAA一直是研究热点。目前制作小鼠实验性腹主动脉瘤(EAAA)模型有3种主要的方法:ApoE-/-小鼠血管紧张素Ⅱ诱导法；普通小鼠猪胰弹性蛋白酶(PPE)灌注法；CaCl2血管周围浸润法[3]。我们前期实验研究中参照文献上报道常规的PPE灌注AAA模型[4-5]，结果发现其成瘤率并不十分理想，而且实验鼠具有一定的瘫痪死亡率。因此建立一种简便、高效的小鼠EAAA模型以便更好地研究AAA病理生理机制是有必要的。针对常规PPE液压灌注法的不足，在本实验中我们设计了一套新型的气压灌注系统进行小鼠腹主动脉瘤的建模实验，并与常规的PPE液压灌注法相比较。

1材料与方法

1.1实验材料

10周龄雄性C57BL/6J小鼠40只(购自北京华阜康生物科技公司)，小鼠体重25~28 g/只；自制PPE气压灌注系统一套(如图1，由立式水银血压计、听诊器胶管、连接管、三通组成)；猪胰弹性蛋白酶(E1250，购自Sigma公司)；4%多聚甲醛(购自武汉谷歌生物科技公司)；500 mL生理盐水一袋，显微器械一套(购自上海金钟医疗器械公司)；11-0、6-0无损伤缝线(购自上海金环医疗用品公司)；卡尔蔡司S7手术显微镜(德国ZEISS公司)。

1.2实验分组及模型建立

40只C57BL/6J小鼠随机分为：常规模型组(n=15)，改良模型组(n=15)，改良对照组(n=10)。常规进行血管游离：小鼠以2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，0.5%活力碘腹部消毒，沿中线切开皮肤，打开腹腔，在8倍手术显微镜下小心游离肾静脉以下约1~1.5 cm长的腹主动脉，11-0缝线结扎侧支动脉。在游离腹主动脉的近端和远端各套过一根6-0丝线作结扎动脉用，中间穿一根丝线作固定灌注导管用。常规模型组采用悬吊136 cm高生理盐水袋法以维持100 mmHg的PPE灌注压(即水压法)，PPE灌注浓度采用4 U/mL，灌注时间为5 min，灌注方向采用逆行灌注，即从小鼠腹主动脉远端(尾端)向近端(头端)方向灌注。改良模型组采用气压灌注系统，连接管内充盈1 mL PPE溶液，连接灌注导管，采用顺行灌注，即从小鼠腹主动脉近端(头端)向远端(尾端)方向灌注。灌注条件：100 mmHg，4 U/mL，5 min。改良对照组用生理盐水替换PPE溶液，其余方法同改良模型组。术毕用11-0缝线封闭主动脉壁插孔，观察腹主动脉充盈良好、恢复搏动后逐层关腹，消毒，普通饮食喂养14 d，每天观察并记录小鼠的存活、活动情况。

1.3动脉瘤形成的判定

灌注开始前，我们对灌注血管进行有标尺参照物的数码拍照后，通过软件测量了每只小鼠的腹主动脉直径。观察14 d后，处死小鼠获取腹主动脉，仔细剥离小鼠腹主动脉周围黏连，再次数码拍照测量血管直径。血管直径增加了50%则可判定为AAA形成。

1.4EVG染色

术后14 d，取小鼠腹主动脉标本，4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，切片进行EVG染色，切片脱蜡后由Verhoeffs染液室温染15~30 min，待颜色变为黑色，用水轻轻冲洗，2%三氯化铁溶液分化10~20 s，显微镜观察弹性纤维呈黑色，背景呈灰色；自来水冲洗，5%硫代硫酸钠处理1 min清除碘；自来水冲洗，蒸馏水稍洗；Van Gieson’s液复染3~5 min，无水乙醇洗；脱水封片。

1.5统计学方法

2结果

2.1改良的PPE气压灌注法构建的小鼠EAAA模型符合动脉瘤形态学特征

术后14 d的观察期内，改良模型组15只实验鼠以及改良对照组10只小鼠无一死亡。通过小鼠腹主动脉标本的收集测量，改良对照组无一成瘤，15只实验鼠中有11只达到了动脉瘤的标准，成瘤率为73.3%，改良模型组成瘤血管肉眼下可以看到灌注段血管明显膨隆，增厚(图1)。

2.2改良的PPE气压灌注法构建的小鼠EAAA模型符合动脉瘤的主要病理学特征

术后14 d，我们对小鼠血管标本进行了EVG染色。与改良对照组相比较，可以看到改良模型组的小鼠腹主动脉组织中的弹性纤维发生了明显的断裂、降解，符合典型的动脉瘤病理学特征(图2)。

2.3改良模型组较常规模型组的成瘤率明显增加

我们的研究结果显示，改良模型组的15只实验鼠中有11只达到动脉瘤标准(成瘤率为73.3%)，而常规模型组的12只实验鼠中(有3只实验鼠观察期内死亡)只有4只达到动脉瘤标准(成瘤率为33.3%)。并且改良模型组第14天小鼠血管直径也明显大于常规模型组[(1.765±0.095)mmvs. (1.440±0.091) mm，P<0.05]。与常规模型组相比较，改良模型组显著提高了成瘤率(P<0.05)。

2.4改良模型组较常规模型组的实验鼠存活率明显增加

改良模型组15只实验鼠在观察期内没有发生死亡和瘫痪。而常规模型组15只小鼠中有3只分别与术后1 d(2只)和3 d(1只)出现后肢瘫痪并死亡。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示两组的存活率差异虽然没有达到统计学意义(P=0.072)，然而就小样本实验来讲，存活率从80%提高到100%还是具有明显的优势。结果表明作为有创操作，顺行灌注较逆行灌注能更好地维持血管通畅，减少术后血管缩窄以及血栓形成的发生。

A：改良对照组中弹性纤维的变化(×100)；B：改良模型组弹性纤维的变化(×100)；C：A图局部放大(×400)；D：B图局部放大(×400)图2　改良对照组与改良模型组小鼠腹主动脉EVG染色对比Fig.2 EVG staining of the aortic samples in modified control and model group

3讨论

3种主要的小鼠实验性腹主动脉瘤模型中，ApoE-/-小鼠血管紧张素Ⅱ诱导法因其造模成本较高，并有一定的主动脉夹层破裂死亡率，在一定程度上限制了该模型的广泛应用。而CaCl2血管周围浸润法因其造模成功率偏低且不稳定，目前在文献报道中的应用也有所减少。PPE灌注法建立小鼠EAAA模型，因其造模成本适中，所致的AAA病理生理特征与人体AAA较为接近，所以广泛地应用于腹主动脉瘤模型的制作中。

在我们的前期实验中发现按照文献报道中的常规方法建模[4]，利用液压维持PPE灌注并不能很好地构建小鼠EAAA模型，并且有一定的死亡率。分析原因有二：①常规法利用悬吊生理盐水136 cm的高度从而产生100 mmHg的PPE灌注压，然而可能对灌注的PPE溶液有一定的稀释作用。如果整袋生理盐水全部按照灌注浓度来配制胰弹性蛋白酶无疑会造成巨大的浪费，并且反复冷藏、复温对酶的活性都会产生影响。②常规法采用的灌注方向为逆行灌注，即由腹主动脉远端(尾端)向近端(头端)灌注。与其他实验动物(如大鼠、兔、犬等)相比较而言，小鼠体型较小，血管较细。游离的腹主动脉远端要细于近端。因此逆行灌注后缝合远端血管壁上的缺口后，容易造成血管缩窄或血栓形成而导致术后后肢瘫痪并死亡。

针对常规法利用水压逆行灌注PPE建立AAA模型的一些问题，我们设计了一套简单、可行、有效的气压灌注系统，并按照我们前期研究中使用的PPE浓度进行小鼠腹主动脉的灌注[6]。该系统避免了常规方法中PPE稀释或试剂浪费等问题，又采用了显微操作下顺行灌注法，小鼠腹主动脉近端相对较粗，缝合管壁缺口后不易造成狭窄或血栓形成，减少了实验鼠的死亡率。正如我们实验中所发现的，改良模型组以及改良对照组实验鼠无一死亡或瘫痪，而常规模型组小鼠的死亡率达到了20%。同样，因为避免了常规法中液体的影响，改良模型组的成瘤率较常规模型组明显增加(73.3%vs. 33.3%，P<0.05)。不管从形态学还是组织病理学，改良PPE气压灌注法都成功地建立了小鼠AAA模型。

也有其他文献报道采用微量注射器维持PPE的加压灌注[7-10]，然而并不能准确地达到并维持100 mmHg的灌注压。目前虽然没有文献明确解释选择100 mmHg灌注压的原因，推测原因是要模拟生理条件下的管壁张力，这样既不造成管壁的外力破坏，又足以使胰弹性蛋白酶渗透进血管内皮细胞进而发挥作用。

本研究创造性地改良了PPE灌注法建立小鼠实验性腹主动脉瘤模型，我们采用自行设计的简单有效的气压灌注系统进行小鼠腹主动脉PPE顺行灌注，便捷、高效地建立AAA模型，为小鼠实验性腹动脉瘤的建立以及动脉瘤的研究提供一个新的方法。

参考文献

[1]Nordon I M，Hinchliffe R J，Loftus I M，et al.Pathophysiology and epidemiology of abdominal aortic aneurysms[J].Nat Rev Cardiol，2011，8(2)：92-102.

[2]Johnston W F，Salmon M，Su G，et al.Genetic and pharmacologic disruption of interleukin-1 beta signaling inhibits experimental aortic aneurysm formation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2013，33(2)：294-304.

[3]Daugherty A，Cassis L A.Mouse models of abdominal aortic aneurysms[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(3)：429-434.

[4]Azuma J，Asagami T，Dalman R，et al.Creation of murine experimental abdominal aortic aneurysms with elastase[J].J Vis Exp，2009，(29)：1280.

[5]武亚丽，童雪影，郑红波，等.改良大鼠腹主动脉瘤模型的建立[J].中国老年学杂志，2014，34(15)：4256-4259.

[6]Wei Z，Wang Y，Zhang K，et al.Inhibiting the Th17/IL-17A-related inflammatory responses with digoxin confers protection against experimental abdominal aortic aneurysm[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34(11)：2429-2438.

[7]许文平，邱健，詹纯列，等.Wistar大鼠腹主动脉瘤模型的建立及改进[J].医学研究生学报，2009，22(4)：347-349.

[8]吴建秋，景在平.两种实验性腹主动脉瘤大鼠模型的比较[J].中国动脉硬化杂志，2002，10(4)：277-280.

[9]Thompson R W，Curci J A，Ennis T L，et al.Pathophysiology of abdominal aortic aneurysms：insights from the elastase-induced model in mice with different genetic backgrounds[J].Ann N Y Acad Sci，2006，1085：59-73.

[10]商弢，刘昭，周敏，等.丹参酮ⅡA抑制腹主动脉瘤基质金属蛋白酶-2及诱导型一氧化氮合酶的研究[J].中华实验外科杂志，2012，29(4)：605-608.

(2015-03-18收稿)

Establishment of Murine Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Models by Modified Barometric Perfusion with Porcine Pancreatic Elastase

Wei Zhanjie1，2，Wang Shuxia3，Yang Yong4etal

1DepartmentofGeneralSurgery，3DepartmentofRadiology，WuhanCentralHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430014，China2DepartmentofCardiovascularSurgery，4DepartmentofCardiology，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

AbstractObjectiveTo investigate a novel method of barometric perfusion with porcine pancreatic elastase(PPE)for establishment of a murine experimental abdominal aortic aneurysm model.MethodsA total of 40 male C57BL/6J mice were divided into three groups randomly：conventional model group(n=15)，modified model group(n=15)，and modified control group(n=10).PPE was perfused to the abdominal aorta under hydraulic pressure for 5 min in a retrograde manner in the conventional model group，and under air pressure in an antegrade manner in the modified model group.Physiological saline was perfused under air pressure in an antegrade manner in the modified control group.Fourteen days after operation，abdominal aortic samples were harvested，the aortic diameter measured and EVG staining performed for statistical and histopathological evaluation.ResultsThe incidence of aortic aneurysm，the aortic diameter and the survival rate were significantly increased in the modified model group as compared with those in the conventional model group[(1.765±0.095)vs.(1.440±0.091) mm for aortic diameter，P<0.05；100%vs.80% for survival rate].EVG staining showed that the elastic fiber was obviously disrupted and degraded in modified model group，which was consistent with the features of abdominal aortic aneurysm.ConclusionA murine abdominal aortic aneurysm model was efficiently established by the novel modified barometric perfusion with PPE.

Key wordsporcine pancreatic elastase(PPE)；mouse；abdominal aortic aneurysm model

中图分类号：R543.1

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.012

通讯作者△，Corresponding author，E-mail：jinping@hust.edu.cn

*国家自然科学基金资助项目(No.81270322，No.81400341)

魏战杰，男，1986年生，医学博士，E-mail：weizhanjie123@163.com