MicroRNA-122结合区遗传变异IL-1A rs3783553与慢性HBV感染的关联研究*

陈雪琴，　王　英，　娄　娇，　杨　洋，　龚雅洁，　朱　颖，　向　成，　钟　荣△

1华中科技大学同济医学院公共卫生学院流行病与卫生统计学系，武汉　430030

2江西省肿瘤医院质控科，南昌　330029

3武汉市疾病预防控制中心病毒科，武汉　430015

4华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，武汉430030



MicroRNA-122结合区遗传变异IL-1A rs3783553与慢性HBV感染的关联研究*

陈雪琴1，2，王英3△，娄娇1，杨洋1，龚雅洁1，朱颖1，向成4，钟荣1△

1华中科技大学同济医学院公共卫生学院流行病与卫生统计学系，武汉430030

2江西省肿瘤医院质控科，南昌330029

3武汉市疾病预防控制中心病毒科，武汉430015

4华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，武汉430030

摘要：目的探讨白细胞介素-1A(IL-1A)基因3′UTR区遗传变异rs3783553与慢性乙型肝炎病毒感染风险的关联。方法采用病例对照研究，选取慢性乙肝病毒感染的病例1 271例，自发性乙肝病毒清除者1 298例。采用ABI 7900HT的TaqMan基因分型技术对遗传变异位点进行检测；采用χ2检验和t检验比较病例组和对照组间人口学特征分布差异，应用非条件Logistic回归分析rs3783553对慢性乙肝病毒感染风险的影响。结果遗传变异位点rs3783553插入(TTCA)等位基因携带者发生慢性乙肝病毒感染风险显著低于缺失等位基因携带者(OR=0.71，95%CI=0.61~0.84)。每增加1个插入等位基因，携带者患慢性乙肝病毒感染的风险降低21%(OR=0.79；95%CI=0.70~0.89)。结论IL-1A基因3′UTR区的遗传变异位点rs3783553与慢性乙肝病毒感染的风险有显著关联。

关键词：rs3783553；慢性乙型肝炎病毒感染；病例对照研究

乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是世界上最普遍的病毒感染，报告显示，世界上有20亿人感染HBV，其中3 500万是病毒的慢性携带者[1]。2010年的全球疾病负担研究显示[2]，HBV感染是全球第10大死亡病因，每年因其死亡的人数达78.6万，已被列为世界首要的公共卫生问题。当宿主感染HBV后，经过肝细胞和免疫系统与病毒的抗争，一部分患者能自发性地将病毒清除体外，一部分患者却逐渐转为慢性感染的状态，进而进一步发展成肝硬化或者肝癌。关于不同个体在感染HBV后获得不同结局的原因及发展机制，目前的研究尚不是很清楚，以往的双生子研究，家族聚集研究以及祖先群体之间的差异研究结果显示，宿主自身因素是决定病毒感染发生发展的首要原因[3]。

在慢性乙肝病毒感染过程中，自身免疫系统在决定病毒感染状态方面发挥着重要的作用。其中，白细胞介素1(Interleukin-1，IL-1)是免疫系统中一类重要的细胞因子，在激活与调节免疫细胞，参与介导T、B细胞活化、增殖和分化，并且在炎症反应中具有重要作用[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长约18~25个核苷酸的非编码RNA分子，它可以通过与目的mRNA的3′UTR、编码区或5′UTR结合，从而发挥转录后的调节功能。研究表明，miRNA在HBV感染和肝癌的发生发展中也发挥着重要的作用[5]。文献显示，位于IL-1A基因3′UTR区的遗传变异位点rs3783553可调控IL-1A的表达，插入基因型可显著上调IL-1A的水平，且与肝癌的发病风险显著相关[6]，而慢性HBV感染不仅是肝癌发生的最主要原因，也是肝癌进展的重要环节。基于IL-1A rs3783553遗传变异在肝癌发生发展中的重要作用，本文采用病例对照研究的方法，对rs3783553与慢性HBV感染风险间的关系进行探讨。

1资料与方法

1.1研究对象

本次研究的病例组为1 271例慢性HBV感染者，2013年9月到2015年1月收自武汉市同济医院体检科，体检者进行了乙肝五项和丙肝抗体的检测。病例组的纳入标准为：乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)阳性、乙肝核心抗体(anti-hepatitis B core antigen，Anti-HBc)阳性、抗丙型肝炎抗体(anti-hepatitis C virus，Anti-HCV)阴性；无肝硬化及肝癌等严重肝脏疾病。剔除有明确乙肝疫苗接种史或既往有肝硬化和肝癌的感染者。本研究选取感染HBV后的自发性清除者作为对照组，研究对象均为同一时期在武汉市同济医院体检科随机抽取的体检者，且与所选病例组无血缘关系，共包含1 298例。HBV自发性清除组的纳入标准为：HBsAg阴性、HBsAb阳性、Anti-HBc阳性、Anti-HCV阴性；健康人群，无肝脏疾病史；无HBV疫苗接种史；武汉地区及其周边地区的人群；年龄(±5)、性别与病例组匹配。病例和对照组的纳入及排除标准均符合文献报道的慢性HBV感染者和HBV自发性清除者的诊断标准[7]。

所有研究对象的相关人口学资料和血液乙肝五项等资料均通过医院病案科电子病例收集。研究对象在签署知情同意书后，由经培训的医护人员用抗凝的采血管采集每位研究对象外周静脉血1 mL。本研究已获得华中科技大学同济医学院伦理委员会的批准。

1.2基因型分析

首先采用百泰克凝固血基因组DNA小量提取试剂盒经过一系列步骤提取血样中的DNA。利用低通量基因分型方法TaqMan对所有样本进行分型。遗传变异位点rs3783553的探针和引物均从上海基康公司订购。位点rs3783553的PCR正反向引物序列分别为5′-ATTGGTCCGATCTTTGAC-TC-3′和5′-TGATAACAGTGGTCTCATGG-3′。引物探针合成后，按照说明配置PCR反应体系，并将其加至384孔板中，每一个384孔板均设置4个阴性对照。采用ABI公司的9700高速基因扩增仪进行PCR反应，严格控制PCR的反应条件，随机抽取6个孔的样本进行凝胶电泳实验以检测PCR的质量。在7900HT荧光定量PCR仪上进行基因分型，采用SDS 2.4软件读取分型后的数据。

1.3统计学方法

基本人口学资料中的年龄等连续性变量采用双侧t检验进行分析，性别、吸烟和饮酒等分类变量采用卡方检验进行分析；采用拟合优度检验分析对照组中rs3783553基因型分布是否符合哈迪-温伯格遗传平衡。采用非条件Logistic回归校正年龄、性别、吸烟和饮酒的混杂影响，计算遗传变异位点rs3783553的校正OR(odds ratios，OR)值及95%可信区间(Confidence internal，CI)。所有数据均采用SPSS 20.0软件包进行分析，检验水准为双侧α=0.05。

2结果

2.1研究对象的基本情况

研究对象共包含1 271例慢性HBV感染者和1 298例HBV自发性清除者，病例组和对照组性别、年龄、吸烟情况和饮酒情况见表1。病例组中男性占64.8%，女性占35.2%；对照组中男性占62.2%，女性占37.8%，两组间性别构成差异无统计学意义(P=0.188)。病例组和对照组的平均年龄分别为(38.30 ±14.22)岁和(38.94±13.50)岁，两组间的年龄差异无统计学意义(P=0.246)。病例组和对照组在吸烟情况(P=0.363)和饮酒情况(P=0.441)方面均无统计学差异。

2.2基因变异位点rs3783553的分型结果

基因分型结果显示，病例组和对照组中都存在缺失/缺失(Del/Del)，缺失/插入(Del/Ins)和插入/插入(Ins/Ins)3种基因型分布。病例组有1 179例分型成功，对照组有1 224例分型成功。对照组的基因型分布进行哈迪-温伯格遗传平衡检验，结果显示其符合哈迪-温伯格遗传平衡定律(P>0.05)，说明对照组的选择具有人群代表性。

表1　研究人群的基本人口学特征

a连续变量采用双侧t检验，b分类变量采用双侧卡方检验。

2.3遗传变异位点rs3783553与慢性HBV感染风险的关联性分析

rs3783553位点的各基因型在慢性HBV感染者和HBV自发性清除者人群中的分布及其与慢性HBV感染风险的关系归纳如表2所示。在多变量Logistic回归模型中经过对年龄、性别、吸烟和饮酒等因素的校正后，相对于Del/Del基因型携带者，Del/Ins基因型携带者患慢性HBV感染的风险降低27%(OR=0.73,95%CI=0.61~0.86)，Ins/Ins基因携带者患慢性HBV感染的风险降低31%(OR=0.69,95%CI=0.52~0.89)。在加性模型中，每增加1个Ins等位基因，携带者患HBV慢性感染的风险降低21%(OR=0.79,95%CI=0.70~0.89)。

表2　rs3783553基因型频率分布及其与HBV慢性感染风险的关系

a经过性别、年龄、吸烟及饮酒校正之后的Logistic回归模型计算

我们进一步对rs3783553与慢性HBV感染风险的关联进行分层分析，运用非条件Logistic回归校正其他因素后在显性模型中的关联结果如表3所示。经过对年龄、性别和吸烟与否进行分层后，rs3783553仍与慢性HBV感染风险显著相关，Ins等位基因可显著降低慢性HBV感染的风险。对研究对象的饮酒情况进行分层后，我们尚未在饮酒人群中发现rs3783553与慢性HBV感染的关联具有统计学意义(OR=0.91,95%CI=0.69~1.20)。

表3　显性模型中rs3783553与慢性HBV感染风险关联分层分析

3讨论

本文通过病例对照研究探讨了位于IL-1A基因3′UTR区的遗传变异rs3783553与慢性HBV感染风险的关联，研究结果显示，与携带缺失基因型的个体相比，携带插入(TTCA)基因型者患慢性HBV感染的风险显著降低，经过对年龄、性别和吸烟与否分层后，rs3783553与慢性HBV感染间的显著关联依然存在于各亚组中，但是尚未在饮酒人群中发现插入基因型可以显著降低慢性HBV感染的风险，仍需进一步研究证实。文献显示，多态位点rs3783553与肝癌、宫颈癌、膀胱癌、卵巢癌和子宫内膜异位症[8-10]等多种疾病的易感性都有显著关联。体内外的研究表明，rs3783553位于microRNA-122及microRNA-378与IL-1A mRNA的结合区域，插入(TTCA)等位基因可以破坏该结合位点，阻碍microRNA-122及microRNA-378与IL-1A mRNA的结合，从而上调IL-1A基因的表达[6]。

IL-1是巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞分泌的一种多肽，是炎症反应中最重要的细胞因子，在免疫反应中发挥重要的作用。IL-1可通过激活NF-κB信号通路抑制乙肝病毒的复制，从而有利于机体将

HBV清出体内[11]。IL-1A和IL-1B是IL-1的2种存在形式，IL-1A分子的不同状态在炎症和免疫反应中具有不同的作用。膜相关性的IL-1A分子可以活化NK细胞和CTL细胞[12]，这些被激活的细胞都是机体免疫系统清除HBV病毒的主力。位于IL-1A基因3′UTR区的遗传变异(rs3783553)通过上调IL-1A的表达，使机体暴露于HBV后，自发性清除HBV的能力增强。

本研究通过选取感染HBV后的自发性清除者作为对照组发现IL-1A基因上的遗传变异位点rs3783553与慢性HBV感染风险有显著关联。相对于HBV暴露史不明确的人群，选择暴露后的人群作为对照的优势在于对照组中不会存在病例的潜在人群，可以深入探讨同样感染了HBV的人群，由于遗传背景的差异，有些个体发展成为慢性HBV感染，而有些个体却可以自发性清除病毒的机制。本研究为病例对照研究，在因果关系的论证强度上具有一定的局限性，仍需前瞻性的队列研究对其进行进一步验证。

参考文献

[1]Liaw Y F，Chu C M.Hepatitis B virus infection[J].Lancet，2009，373(9663)：582-592.

[2]Lozano R，Naghavi M，Foreman K，et al.Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010[J].Lancet，2012，380(9859)：2095-2128.

[3]He Y L，Zhao Y R，Zhang S L，et al.Host susceptibility to persistent hepatitis B virus infection[J].World J Gastroenterol，2006，12(30)：4788-4793.

[4]Apte R N，Voronov E.Interleukin-1—a major pleiotropic cytokine in tumor-host interactions[J].Semin Cancer Biol，2002，12(4)：277-290.

[5]Zhang Q，Pu R，Du Y，et al.Non-coding RNAs in hepatitis B or C-associated hepatocellular carcinoma：potential diagnostic and prognostic markers and therapeutic targets[J].Cancer Lett，2012，321(1)：1-12.

[6]Gao Y，He Y，Ding J，et al.An insertion/deletion polymorphism at miRNA-122-binding site in the interleukin-1 alpha 3′untranslated region confers risk for hepatocellular carcinoma[J].Carcinogenesis，2009，30(12)：2064-2069.

[7]Hu L，Zhai X，Liu J，et al.Genetic variants in human leukocyte antigen/DP-DQ influence both hepatitis B virus clearance and hepatocellular carcinoma development[J].Hepatology，2012，55(5)：1426-1431.

[8]Huang J，Ni S，Li D，et al.Aninsertion/deletion polymorphism at miRNA-122 binding site in the IL-1A is associated with a reduced risk of cervical squamous cell carcinoma[J].Genet Test Mol Biomarkers，2015，19(6)：331-334.

[9]Zhang Z，Zhou B，Gao Q，et al.A polymorphism at miRNA-122-binding site in the IL-1 alpha 3′UTR is associated with risk of epithelial ovarian cancer[J].Fam Cancer，2014，13(4)：595-601.

[10]Hata Y，Nakaoka H，Yoshihara K，et al.A nonsynonymous variant of IL-1A is associated with endometriosis in Japanese population[J].J Hum Genet，2013，58(8)：517-520.

[11]Watashi K，Liang G，Iwamoto M，et al.Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha trigger restriction of hepatitis B virus infection via a cytidine deaminase activation-induced cytidine deaminase(AID)[J].J Biol Chem，2013，288(44)：31715-31727.

[12]Apte R N，Voronov E.Is interleukin-1 a good or bad ‘guy’ in tumor immunobiology and immunotherapy?[J].Immunol Rev，2008，222：222-241.

(2015-06-15收稿)

Association of Genetic Variant rs3783553 at MicroRNA122-binding Site in IL-1A Gene with Risk of Chronic HBV Infection

Chen Xueqin1，2，Wang Ying3△，Lou Jiao1etal

1DepartmentofEpidemiologyandHealthStatistics，SchoolofPublicHealth，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofMedicalQualityControl，TheTumorHospitalofJiangxiProvince，Nanchang330029，China3VirusLaboratory，WuhanCenterforDiseaseControlandPrevention，Wuhan430015，China

AbstractObjectiveTo explore the association of the genetic variant rs3783553 in IL-1A 3′UTR with the risk of chronic HBV infection.MethodsIn this case-control study，genetic variant rs3783553 was genotyped by TaqMan PCR genotyping method in 1 271 patients with chronic HBV infection and 1 298 subjects with HBV natural clearance.χ2test andttest were employed to compare the distribution difference of demographic characteristics between case and control groups.The contribution of rs3783553 to chronic HBV infection was analyzed by unconditional Logistic regression.ResultsCarriers with TTCA insertion allele of rs3783553 were less likely to develop chronic HBV infection than those with deletion allele(OR=0.71；95%CI=0.61-0.84).With one increment of insertion allele，the risk of chronic HBV infection decreased by 21%(OR=0.79；95%CI=0.70-0.89).ConclusionGenetic variant rs3783553 in IL-1A 3′UTR is closely associated with the risk of chronic HBV infection.

Key wordsrs3783553；chronic HBV infection；case-control study

中图分类号：R512.6

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.011

通讯作者△，Corresponding author，王英，E-mail：wangyingxiehe@163.com；钟荣，E-mail：rongzhong91@gmail.com

*中国博士后科学基金资助项目(No.2014M550395)；武汉市创新人才开发基金资助项目

陈雪琴，女，1990年生，硕士研究生，E-mail：xueqin1206101@163.com