诱导性多能干细胞的安全性及其在肝细胞再生方面的应用潜能

张雪　明雅南　张岚



·综述·

诱导性多能干细胞的安全性及其在肝细胞再生方面的应用潜能

张雪明雅南张岚

200127上海交通大学医学院附属仁济医院血管外科(张雪、张岚)；上海交通大学医学院附属仁济医院、上海市消化病研究所(明雅南)

2006年，Takahashi等[1]运用逆转录病毒将4个与胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)多能性密切相关的基因Oct-4、Sox2、c-Myc及Klf4导入到小鼠胚胎成纤维细胞和小鼠尾尖成纤维细胞中，成功将其重编程为具有ESCs多能性的细胞，命名为诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)。2007年,Yamanaka研究小组进一步利用Nanog代替Fbx15进行筛选,得到了Nanog+的iPSCs系,这样取得的iPSCs更接近于胚胎干细胞[2]。研究表明，iPSCs在体外可诱导分化成诸多目的细胞，如原始生殖细胞[3]、神经细胞[4]、心血管细胞[5, 6]以及肝脏细胞[7]等，在疾病治疗中具有巨大应用价值。iPSCs优势明显，不仅继承了成体干细胞和ESCs各自的优点，且来源比成体干细胞丰富，并克服了与ESCs相关的免疫原性和伦理学争议，成为再生医学领域最有潜力的种子细胞[8]。但是，iPSCs诱导分化的安全性(如致瘤性)却是其临床运用的一大障碍[9]。

肝脏是人体的“加工厂”，在生命体中起着解毒、代谢、分泌胆汁、免疫防御以及造血、储血和调节循环血量等重要功能。但肝脏很容易患上如肝炎、肝硬化以及肝癌等疾病，且早期往往没有明显症状，已成为严重威胁人类健康的“隐形杀手”[10]。目前，对于终末期肝病仍然没有有效的治疗措施，原位肝移植(Orthotopic liver transplantation, OLT)成为了疾病治疗最后的保障，然而供肝短缺、费用昂贵、高手术风险、免疫排斥而需要服用免疫抑制剂等因素严重限制其发展[11]。近年来，干细胞移植疗法在治疗终末期肝病方面有效性凸显，其中以iPSCs最引人关注。研究表明，iPSCs来源的肝细胞(iPSCs derived hepatocytes,iPSC-Heps)在动物肝脏损伤、衰竭等模型中发挥良好的治疗效果[12-14]。

尽管iPSCs存在安全隐患，但其在肝细胞再生治疗终末期肝病方面具有巨大的应用潜能。

一、iPSCs诱导分化的安全性

综观近年来iPSCs安全性方面的研究，一般认为主要通过以下几种途径提高其诱导分化的安全性。

(一)通过改变诱导因子及其载体提高iPSCs的安全性由于重编程iPSCs的诱导因子如c-Myc等本身就是致瘤基因，导入后增加了iPSCs的致瘤风险，所以减少诱导因子的数量或重编程后敲除致瘤基因可降低iPSCs致瘤性。有研究发现仅导入三个基因(Oct4、Sox2、Klf4)甚至二个基因(Oct4、Sox2)也可以得到iPSCs，虽然诱导效率下降，但降低了iPSCs的致瘤风险[15, 16]。Soldner等[17]使用一种基因编码技术将转录因子的基因序列两端留存特殊标志，重编程完成后使用Cre-重组酶识别此标志并移除转录因子。也有研究者使用piggyBac转座子重编系统[18]，当使用piggyBac转座子成功编程后再表达转座酶删除转座子，获得无外源性病毒载体及转录因子的iPSCs。除了转录因子，其传统载体包括反转录病毒、慢病毒以及腺相关病毒载体等难免嵌入细胞染色体，增加癌变风险。要想更安全的临床应用iPSCs，非整合性载体如质粒、重组腺病毒载体[19, 20]是较好的选择。Zhou T等[21]使用episomal载体将六种胚胎相关基因(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog)导入肾脏上皮细胞，成功诱导成为人iPSCs，从而避免了使用病毒载体,提高了移植安全性。另外，Margaritia等[22]发现从体细胞重编程的早期阶段到多能状态,特定的基因表达模式会发生改变。因此，不减少转录因子的数量，仅将重编程时间缩短为4 d就可生成部分iPSCs(Partial iPSCs，PiPSCs)，移植到体内后不形成肿瘤。

(二)通过细胞分选技术提高iPSCs的安全性移植前使用细胞分选技术，包括荧光活化细胞分选(Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS)、磁性活化细胞分选(Magnetic Activated Cell Sorting，MACS)等对细胞进行纯化可提高iPSCs移植后安全性。Doi等[23]运用FACS有效分选出CORIN+人iPSCs来源的中脑多巴胺能神经祖细胞，此类细胞表达中脑多巴胺能神经祖细胞标记FOXA2和LMX1A。CORIN+细胞移植到6-羟基多巴胺帕金森病模型大鼠体内后存活并分化为中脑多巴胺能神经元，显著提高其运动能力且不形成肿瘤。Polanco等[24]发现使用病毒转导或者游离非整合载体获得的处于分化极早期的人iPSCs表现出还原到多潜能表型的倾向，增加了iPSCs的致瘤风险。对此类细胞进行有效的分离及监控将有助于提高安全性。研究人员基于细胞表面标记TG30(CD9)和GCTM-2的表达使用FACS识别处于分化极早期的多潜能细胞。经FACS分离后的已分化细胞重新获得对于TG30(CD9)和GCTM-2的免疫反应，形成干细胞样集落，重新表达常见的多能性标志物，并在免疫功能不全小鼠体内形成畸胎瘤。因此，可通过激光技术发现并鉴定iPSCs表面特异性蛋白，基于特异性蛋白的存在与否分离出这些iPSCs并进行监控，不安全的iPSCs系形成可识别的细胞聚集体，可用于筛选出安全的iPSCs。

(三)通过清除残留的未分化细胞提高iPSCs的安全性残留的未分化细胞也是引起iPSCs移植术后肿瘤形成的主要原因。因此，消除未分化细胞成分是实现iPSCs治疗无瘤化的有效策略。目前，一些实验室已经集中筛选拥有选择性地诱导多能干细胞死亡能力的小分子,这些分子有应用到临床以消除未分化干细胞的潜力。Wyles SP等[25]发现DNA拓扑异构酶II抑制剂依托泊苷可清除早期心脏祖细胞群中的多能细胞从而抑制畸胎瘤的形成。将治疗剂量的部分分化iPSCs来源的心脏祖细胞移植到心梗的免疫缺陷小鼠心脏内，依托泊苷处理组相比于对照组降低了肿瘤形成的风险。Ben.David等[26]对超过52000个小分子进行高通量筛选并确定了15个多潜能干细胞特异性抑制剂(PluriSins)。在这些分子中, 硬脂酰基-辅酶A脱氢酶(Stearoyl-CoA Desaturase，SCD)抑制剂PluriSin#1作为多能干细胞特异性抑制剂在诱导人ESCs的细胞毒性方面显示出高效率，能够选择性清除人类多能干细胞，而对组织特异性干/祖细胞以及已分化细胞却无此作用，有望彻底攻克iPSC致瘤性这一难题。由于iPSCs和ESCs在基因和蛋白表达方面有显著的差异，关于PluriSin#1对ESCs致瘤性的影响的数据不能直接外推到iPSCs。有鉴于此，本课题组对PluriSin#1在克服iPSCs的致瘤性方面做了深入研究，发现Nanog阳性细胞在心脏中是形成iPS衍生物(induced Pluripotent Stem Derivative，iPSD)来源肿瘤的主要启动细胞，PluriSin#1能选择性地消除Nanog+的iPSD，抑制了肿瘤的形成且并不增加Nanog-细胞的凋亡。我们进一步将经PluriSin#1和二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)处理的iPSD分别注射入心梗模型小鼠的心肌内，PluriSin#1组的小鼠体内不形成肿瘤，可见消除残余的Nanog+细胞可预防肿瘤的发生[6]。

尽管iPSCs从发现至今只有近十年时间，但是进展十分迅速。研究人员不断对iPSCs分化过程中的各个环节进行优化和改进，在提高其应用安全性方面已取得了一定的成果。

二、iPSCs诱导分化为肝细胞

Chiang等[7]诱导iPSCs分化为类肝细胞，表达多种肝脏特异性标记物(白蛋白、甲胎蛋白、肝细胞核因子3β等)，符合正常肝细胞生物学特性。Chang等[27]发现，无重编程因子c-Myc的iPSCs也具有分化成肝细胞的能力。Chiang等[28]诱导人牙髓来源的成纤维细胞为iPSCs，并进一步分化为类肝细胞，与人ESCs来源的肝细胞相似。Liu等[13]运用相同的分化与移植方案评估了来源于各个胚层组织(外胚层、中胚层和内胚层)的iPSCs诱导分化为肝细胞的能力，发现分化所得iPSC-Heps都能定植到小鼠肝脏，且能促进肝硬化小鼠肝脏组织再生。但是，传统培养方法获得iPSCs-Heps的效率欠佳。Zhang等[29]改进诱导方案，运用3D培养系统诱导人iPSCs来源的同源性肝脏内胚层细胞(Hepatic endoderm cells,iPSC-HEs)分化为功能性类肝细胞。iPSC-HEs培养在3D微型培养板中。第4天，iPSC-Hes集聚形成许多大小一致(直径约100-200μm)，分布均匀的球状体。第14天，球状体分化为类肝细胞，表达肝脏标志基因，效率比传统方法更高。Choi等[30]也通过改进诱导分化方案获得不同组织器官起源的病人特异性的iPSC-Heps。Chen等[31]等发现肝细胞生长因子可增强活化素A和Wnt3a的效力，提高内胚层标志物Foxa2的表达。所得iPSC-Heps具有与成熟肝细胞相似的基因表达谱，并且具有细胞色素P450酶活性，可分泌尿素、摄取低密度脂蛋白、储存糖原。Chien等[32]运用非病毒载体提呈miR-122，缩短了iPSCs分化为肝细胞的时间。Nagamoto等[33]将表达FNK(一种来自Bcl-xL的极度活跃的突变基因)的腺病毒载体转染hiPSC-Heps得到hiPSC-Heps/ FNK，并将其移植到严重联合免疫缺陷FNK基因敲除小鼠体内，提高了肝细胞再生效率。

三、iPSC-Heps的应用潜能

研究表明，iPSCs促进肝细胞再生的有效性显著。移植iPSC-Heps对于四氯化碳(CCl4)或对硫代乙酰胺诱导的小鼠急性/暴发性肝衰具有明显的保护活性，有效减少了肝脏坏死面积，改善肝脏功能[7, 27]。iPSC-Heps表现出多种抗氧化酶活性，阻止CCl4诱导的活性氧的产生及细胞死亡。此外，移植iPSC-Heps还可以改善CCl4诱导的肝性脑病[27]。Chiang等[28]为了提高类肝细胞的移植能力开发了一种可持续释放肝细胞生长因子的可注射性羧甲基己酰壳聚糖水凝胶(HGF-CHC)，研究了已递呈HGF-CHC的类肝细胞在体外和在硫代乙酰胺诱导的免疫功能不全小鼠的AHF模型体内的肝脏保护效应。相比 于PBS处理的iPSC-Heps，肝内提呈HGF-CHC-iPSC-Heps表现出更高的抗氧化抗凋亡活性，减少了肝脏坏死面积。此外，该肝脏保护效应可被抗HGF 中和抗体消除。可见，HGF-CHC是iPSC-Heps移植治疗AHF 理想的载体。Chien等[32]运用CHC提呈miR122-iPSC-Heps，表现出明显的体内肝脏保护效应，有望促进AHF肝脏再生。腹腔内注射氨基半乳糖常被用于诱导大鼠致死性急性肝衰模型，三天内死亡率高达90%。Ramanathan等[34]分别将hiPSC-Heps、hiPSC-Heps及内皮细胞的混合细胞移植到急性肝衰的无胸腺裸大鼠脾脏，提高了大鼠存活率。移植后第三天，超过一半的大鼠血清中可检测到人血清蛋白。但半个月后，只有在移植混合细胞的大鼠血清中可检测到人血清蛋白。Chen等[31]发现人iPSC-Heps在体内实验中，可促进肝脏再生，挽救暴发性肝功能衰竭的非肥胖糖尿病严重联合免疫缺陷小鼠生命。Zhang等[35]在肝细胞分化中期发现，人iPSC-HEs中包含最高含量的Ki67+细胞，证实该时期存在丰富的增殖肝脏祖细胞，其分化与扩增在移植治疗肝脏疾病方面有乐观的应用前景。Takebe[14, 36]将人体皮肤细胞来源的iPSCs诱导分化为早期肝细胞，与人类脐静脉内皮细胞和MSCs混合，很快形成肉眼可见的立体细胞团。5 d后，细胞团形成微三维结构-“肝芽”，功能类似小型肝脏。随后将“肝芽”移植到免疫缺陷小鼠体内，“肝芽”在48 h之内与小鼠血管连接，约10 d后，开始正常工作。“肝芽”的基因表达谱与人类胎儿肝组织相近，移植到小鼠体内的“肝芽”与成人肝脏具有相似的代谢功能。后续实验发现，对更昔洛韦诱导的肝衰竭小鼠行“肝芽”移植可提高存活率。Lau等[37]将iPSCs分化细胞封装入3D支架系统来制造植入式复合物用于肝脏再生。该研究团队以微孔水凝胶作为细胞集落及胚体形成和分化的平台，在干细胞生成集落和胚体后进一步诱导其向肝细胞系分化，分化所得细胞内肝脏特定基因和标记物上调。微孔水凝胶能加强营养交换，为封装入的干细胞提供更大的空间以快速生成集落和胚体。相比于单层细胞培养，3D培养产生的尿素和白蛋白明显增加，也证实此系统的优越性。

四、问题与展望

目前人工肝脏研究进展缓慢，肝细胞来源问题是主要瓶颈之一，肝细胞移植技术也同样面临此问题。iPSCs因其独特的优势已成为移植用肝细胞的理想来源。虽然iPSC-Heps促进肝脏再生作用显著,但iPSCs的诱导效率和安全性、iPSC-Heps的功能、移植时间窗、途径等问题仍需重视。目前已经有学者研究出微型肝脏，如“肝芽”，但规模仍太小且结构并不完整。如何使“肝芽”发育成熟、结构功能完善(胆管生成)将是急需解答的课题。

随着研究的深入，iPSCs临床推广所面临的障碍必将一一扫除，在肝细胞再生方面的应用必将给终末期肝病患者带来福音。

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(本文编辑：张苗)

基金项目：上海市科委国际科技合作基金(14430721400)

通信作者：张岚，Email: rjzhanglan@sjtu.edu.cn

(收稿日期：2015-12-20)