诱导多能干细胞治疗动物骨骼病的研究进展

付晓森，刘凤军，张玉玲，董文亚，李毅恒，刘向阳

(河南科技大学，河南洛阳 471003)



诱导多能干细胞治疗动物骨骼病的研究进展

付晓森，刘凤军*，张玉玲，董文亚，李毅恒，刘向阳

(河南科技大学，河南洛阳 471003)

摘要:由于骨骼疾病恢复所需时间较长、动物不配合治疗等原因，给动物骨骼疾病治疗带来了较大困难，缩短治疗周期将会大大提高动物骨骼疾病治疗的成功率，而传统方法已无法再超越目前的治疗周期。诱导多能干细胞(IPS)具有强大的增殖和分化能力，可分化为修复骨骼病所需的多种细胞以及细胞因子等，这为加速动物骨骼疾病痊愈带来了新的希望。论文对IPS的研发历程及优势，IPS向骨细胞分化，IPS在治疗骨骼病中的应用等方面进行了综述，并对其治疗动物骨折的前景进行了展望。

关键词:多能干细胞；诱导分化；动物骨骼疾病；骨细胞；治疗

以动物骨折为代表的动物骨骼病在畜牧生产和兽医临床上非常常见，对于一般性生产动物可以选择直接淘汰，但对于具有较高价值的珍稀野生动物、种畜、特种经济动物、宠物等要进行积极治疗。骨折是指骨结构的连续性完全或部分断裂。骨折会给患者带来极大疼痛，并影响其正常生活，严重者会造成残疾(如体态畸形、肢体残缺等)[1]，甚至危及生命。骨折若经及时恰当处理，多数病例能恢复原来的功能，少数病例可能遗留不同程度的后遗症(如关节僵硬或强直等)。

动物不愿配合治疗及骨折愈合所需时间较长都严重影响动物骨折的治疗效果。随着人类医学的发展，许多治疗骨折的理论、方法、技术已广泛应用到动物骨折治疗中，如外固定技术和内固定技术。外固定具有固定可靠、骨折愈合快、功能恢复好、治疗费用低、并发症少等优点，但固定太松或固定垫使用不当易出现骨折再移位，固定太紧可导致压迫性溃疡、缺血性肌痉挛，甚至肢体坏疽；内固定主要用于切开复位后，采用金属内固定物，将骨折断端复位后予以固定，优点是可以较好地保持骨折的解剖复位，缺点是固定物属机体异物，在其下面及周围易发生骨质疏松或者松动，且一旦感染，将会严重地阻碍伤口和骨折愈合。同时，安置内固定物时，需广泛剥离软组织和骨膜，影响血液运输，延迟骨折愈合。此外，在骨折治疗过程中，动物常挣扎反抗，不配合治疗，这使得兽医不得不把骨折部位固定相对牢固，这可造成骨折延迟愈合或不愈合及恢复期内因缺乏活动导致的肌肉萎缩。即使把骨折处固定好后，动物也会随着机体恢复而抓、啃、蹭骨折固定部位，影响骨折愈合效果。因此，如何加速动物骨折愈合对兽医来说也是一个难题。

干细胞研究为加速骨折愈合带来了新希望。干细胞具有强大的再生、分化能力，可以分化成多种类型的细胞及组织器官，其中包括骨细胞及软骨组织。干细胞之所以能加速骨折愈合，是因为它可以加速修复损伤的骨组织或分化成骨组织，然后通过移植替代相应的受损骨组织，进而使机体恢复到受伤前的状态[2-5]。目前已知胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)、间充质干细胞等干细胞可以修复骨骼，而最近兴起的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，IPS)除了可以分化出多种类型细胞和一些组织外也具有同样的修复能力。论文就近年来国内外在IPS向骨细胞分化及其在骨骼病的研究应用进行了综述和展望。

1IPS研究概况

IPS是通过采用导入外源基因的方法使体细胞去分化为多能干细胞，具有与ES相似的细胞全能性，在一定条件下，可分化为多种功能细胞或组织器官。最早由日本的两位科学家Yamanaka K和Takahashi S于2006年报道的[6]，他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这4种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的IPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与ES相似。与ES相比，IPS不会面临长期困扰ES研究与应用在法律、伦理道德等方面的问题，由于是使用同一机体的细胞进行诱导分化移植因而基本不会产生免疫排斥反应；与成体干细胞相比，IPS来源广泛、取材方便，并且可以向更多细胞类型、更广方向分化。可见，IPS可谓是集ES与成体干细胞的优点于一体。

IPS给再生医学和临床治疗疾病带来了新希望。Karumbayaram S等用IPS首次分化出人运动神经细胞。之后，科学家们陆续发现IPS还可分化为血小板、抗癌细胞、胰腺、色素细胞、软骨组织、牙齿等[7-8]。最令人惊喜的是IPS的四倍体补偿试验和利用IPS克隆出活体试验小鼠，这证明IPS与ES一样具有全能性，同时也为IPS临床应用的研究注入了新的活力[9]。这些研究表明，IPS有修复动物骨折的潜能。

2IPS向骨细胞分化

IPS通过诱导分化出与骨发育密切相关的因子或细胞，在骨折修复中起促进作用。骨组织中的成骨蛋白、骨钙蛋白、骨粘连蛋白与骨发育、骨修复密切相关；同时，骨细胞中的成骨细胞和破骨细胞是参与骨形成(即骨化)的主要细胞。调控成骨细胞发育的转录因子主要有Sox9、Runx2、Dlx5、Twist1等，调控破骨细胞发育的转录因子主要有RANKL、M-CSF、PU.1、MITF、c-FOS等，这些转录因子调控成骨细胞和破骨细胞偶联，在骨发育、骨重塑、骨修复的全过程中都是非常重要的[10]。

学者们在这方面进行了尝试，并取得了一定成果。2011年，Bilousova G等利用IPS技术成功地分化出小鼠软骨细胞。2012年，Hayashi T等发现IPS向骨分化过程的第3周骨钙蛋白表达最高。2014年，Phillips M D等[11]让IPS分别在体内和体外向骨细胞分化，结果显示都可以向骨细胞分化。

TheinHan W等先将IPS分化为间充质干细胞，然后使用分化剂诱导其向骨分化，结果发现有肌动蛋白纤维表达、成骨细胞存在并有矿化基质形成。任秋颖等[12]在小鼠IPS骨向分化过程中添加成骨蛋白7(BMP7)，结果发现试验组的矿化结节率明显增高。 Kato H[13]的课题组把1,25-二羟基维生素D3加到IPS向骨细胞分化培养液中，6 d后观察有成骨细胞出现。伊朗医学家Ardeshirylajimi A和Soleimani M[14]把将要向骨细胞分化的IPS放到极低频电磁场(50 Hz)下进行培养，一段时间后用MTT法测定发现，被标记的碱性磷酸酶(ALP)活性增强、钙物质沉积增多，同时发现在一定范围内适当增加极低频电磁场强度，以上指标会有所提高。这些研究为IPS向骨细胞分化提供了新方法、新思路，为后续相关研究奠定了基础。

3干细胞治疗骨骼病

干细胞治疗是把健康的干细胞移植到病人或自己体内，以达到修复病变组织器官或重建功能正常的组织器官的目的。干细胞疗法就像给机体注入新的活力，是从根本上治疗许多疾病的有效方法。干细胞治疗最早始于1956年，美国医生Thomas E D应用双胞胎间的骨髓移植成功地治疗了白血病，开启了干细胞治疗疾病的新时代。到目前为止，人们陆续发现干细胞可以改善心脏功能、治疗Ⅰ型糖尿病[15]、缓解帕金森症状、修复视网膜[16]等。这些临床试验为干细胞应用于临床打下了基础。

干细胞治疗骨骼疾病的探索始于20世纪末，并取得了初步的成果。1991年Connolly J F利用自体骨髓血移植成功治疗了胫骨骨折迁延不愈； 1999年Horwitz E M等通过自体骨髓间充质细胞移植治疗儿童成骨不全症，取得了不错的效果。2003年Tsuchida H等[2]从大鼠体内提取间充质干细胞并对其成骨蛋白2基因进行了修饰，然后将其应用于有股骨节段性缺陷的大鼠，结果显示大鼠的股骨得到了修复。这为同种异体动物间进行干细胞治疗骨折提供了科学依据，开辟了干细胞治疗骨骼疾病的新纪元。

2011年Xue G等将培养纯化好的脐带间充质干细胞，通过静脉注射的方式输入有骨折不愈合和神经受损的患者体内，治疗2个月后患者骨折处有愈合并对外界反应变得灵敏，1年后对患者进行随访观察，基本没有副作用。2012年Obermeyer T S等探讨了滥用酒精和静脉注射间充质干细胞对小鼠胫骨骨折模型骨折愈合的影响，结果发现，滥用酒精会明显降低骨折的修复速度，但应用间充质干细胞治疗可以提高其修复速度。2015年Wang P等[17]对IPS、骨髓间充质干细胞和脐带干细胞向骨分化能力的比较，将上述3种干细胞分别移植到颅骨缺损的不同大鼠身上，12周后对长出的骨面积分析比较，结果显示差异不显著，说明这3种干细胞向骨分化的能力相当。

近年来，新型材料与干细胞结合应用到骨折治疗研究上。Kingham E[18]研究团队在塑性材料表面上培养人ES并评估其向骨细胞分化的能力，以期将来把塑性材料和培养好的细胞直接作用到骨折处修复损伤。Bradley F等[19]发明了一种刚硬轻型塑料，其可被患者自己的干细胞植入附着，并生长出新的骨细胞，这种塑料会随着新的骨组织生长逐渐地发生降解而被替换，这种方法将来很可能用来治疗粉碎性骨折。

4IPS治疗骨骼病

IPS诱导分化为间充质干细胞后，能够间接用于骨组织的再生与修复。骨是由胚胎时期的间充质细胞分化发育来的，很多试验已经证明，间充质干细胞可以分化为骨系细胞并形成软骨和骨[20]，有些试验成果已经应用于临床治疗。

目前，兽医临床上用于治疗骨骼疾病的干细胞主要是间充质干细胞，而且取得了不错的成绩[21]。由于间充质干细胞来源有限、传代后分化能力减弱，推广应用受到限制。而IPS分化为间充质干细胞，为其间接向骨系细胞分化注入了活力，有试验证明源于IPS的间充质干细胞比直接从骨髓获取的间充质干细胞更有活力，并且一样可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。另有试验报道[22]， IPS分化成间充质干细胞后，将其移植到有牙周缺陷的小鼠体内，随后发现移植部位有矿化组织形成，这为IPS分化为间充质干细胞后治疗骨折开辟了新思路。

对于该领域的研究，值得一提的是2012年美国科学家Diekman B O等[5]利用IPS技术在体外培养下分化出软骨组织。他们先建立了体外软骨缺损模型，然后把导入有绿色荧光蛋白(GFP)基因的IPS进行骨化培养，随后将培养的细胞移植到软骨缺损模型上。21 d后，通过观察绿色荧光蛋白确定有软骨基质生成与集合，软骨缺损部位周围出现软骨组织。这是科学家首次利用IPS技术获得的成型骨结构。

IPS分化为成型再生器官——牙齿。2013年中国科学家成功利用人尿液IPS获得了再生牙齿[23]。他们首先把ifhU-iPSCs(人的IPS)分化上皮细胞,并与牙齿缺失老鼠的牙间质结合。3周后有30%的老鼠牙间质出现牙齿结构，进一步研究发现分化出的牙齿拥有与人类牙齿相似的结构和硬度。这是科学家首次利用人IPS获得成型的再生器官，为将来IPS技术应用于器官再生奠定了基础。

5展望

虽然IPS技术在向骨细胞分化方面取得了一定的成果[24]，尤其是在软骨受损和骨关节炎研究方面。但是还存在一些问题，如IPS面临没有统一规范的诱导步骤、诱导率低、可能形成肿瘤、带有表观遗传记忆、基因组不稳定等[25]，但其在治疗动物疾病的应用上前景广阔。

首先，可操作性较强。目前干细胞治疗在医学上取得了一定的成果，但由于缺乏统一治疗标准和存在产生肿瘤的风险以及法律方面的限制，其在医学上的应用和推广受到限制。而动物方面面临的问题相比要少得多：一方面，在进行动物治疗前可以先用其他动物进行治疗试验，然后评价治疗的效果和存在的风险，最后决定是否进行治疗及如何进行治疗；另一方面，动物治疗涉及的法律问题较少、监管相对宽松，方便进行试验和治疗。

其次，经济效益前景广阔。具有治疗价值的动物除了野生动物和种畜外，另一个不容忽视的大群体就是宠物。随着宠物饲养量的日益增多，车祸、打斗、高处坠落等原因造成的宠物骨折数量也在上升，开篇提到的动物骨折延迟愈合或不愈合问题在宠物上凸显出来。在发达国家，有些动物医院已经开始使用干细胞治疗宠物骨骼疾病，且宠物恢复良好。据悉，一例宠物干细胞治疗的费用大约在2 000元。截止2013年，中国宠物的数量大约有1.2亿只，而且数量还在持续快速增长。而用传统手术方法治疗一例骨折的费用从1 500元到上万元不等，因而干细胞治疗的费用并不算高，而且与手术治疗相比干细胞治疗风险要小的多。大体估算目前我国宠物发生骨折的概率是千分之一，而采用干细胞治疗骨折的概率是十分之一，那么每年至少可产生2 400万元的经济效益。随着干细胞治疗技术逐渐成熟，进行干细胞治疗的动物会越来越多，而产生的经济效益则会快速增长。

综上所述，尽管目前IPS治疗骨折的技术尚不成熟，存在着一些不足，但相信随着ISP技术的发展，安全、高效的IPS技术治疗动物骨折终将取得突破并实现临床应用，同时也将产生巨大的经济和社会价值。

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Progress on Treatment of Animal Orthopedic Diseases with Induced Pluripotent Stem Cells

FU Xiao-sen，LIU Feng-jun，ZHANG Yu-ling，DONG Wen-ya，LI Yi-heng，LIU Xiang-yang

(HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan,471003，China)

Abstract:Greater difficulties to treat animal orthopedic diseases were the longer recovery duration and uncooperative animals during treatment.Thus,shortening the treatment period may greatly improve the success rate of treatment of animal bone diseases,but traditional methods cannot exceed the current treatment cycle.Induced pluripotent stem cells (IPS) with a strong proliferation and differentiation can differentiate into a variety of cells and factors needed to repair bone disease,which bring new hope to accelerate healing of animal orthopedic diseases.This paper reviewed the research and development process of IPS,its advantages,differentiation into bone cells,and application to treat orthopedic diseases.Meanwhile,the paper also fores the prospects of IPS treatment for animal bone fracture.

Key words:pluripotent stem cell；induced differentiate；animal orthopedic disease；bone cell；treatment

文章编号:1007-5038(2016)03-0099-04

中图分类号:S857.161

文献标识码:A

作者简介：付晓森(1989-)，男，河南安阳人，硕士研究生，主要从事小动物疾病防治研究。*通讯作者

基金项目：国家自然科学基金项目(30901026);河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目(2010GGJS-071)

收稿日期：2015-07-20