NLRP3炎性小体、胆固醇结晶与动脉粥样硬化关系的研究进展

罗彩云，丁家望，郑霞霞，周天

(三峡大学第一临床医学院，宜昌市中心人民医院心内科，湖北 宜昌 443002)

NLRP3炎性小体、胆固醇结晶与动脉粥样硬化关系的研究进展

罗彩云，丁家望，郑霞霞，周天

(三峡大学第一临床医学院，宜昌市中心人民医院心内科，湖北 宜昌 443002)

动脉粥样硬化(AS)与血管内皮功能障碍、炎症、自身免疫等多种因素有关，是以血管壁炎症反应为基础的慢性病理过程。近来研究表明，炎性小体(Inflammasome)是炎症反应的核心。炎性小体作为固有免疫的一种模式识别受体，通过激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1(Caspase1)，介导炎性因子的分泌，参与各种炎症性疾病包括动脉粥样硬化的发生发展。胆固醇结晶被认为是动脉粥样硬化病变的标志，作为内源性物质之一能激活NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体，促进动脉粥样硬化的发展。为了给研究动脉粥样硬化抗炎症治疗提供新思路、新靶点，我们现将炎性小体活化及调控与胆固醇结晶、动脉粥样硬化关系研究进展做一综述。

NLRP3炎性小体；胆固醇结晶；动脉粥样硬化

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种慢性炎症性疾病，固有免疫和适应性免疫均参与动脉粥样硬化的炎症病理过程。炎性小体(Inflammasome)作为固有免疫的重要组成成分，能被多种病原相关分子模式或损伤相关分子模式激活，活化半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1(Cysteine aspartate-specific protease 1，Caspase1)介导炎症反应[1]，从而参与痛风、Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化等多种疾病的发展过程。动脉粥样硬化斑块病变具有脂质异常沉积、炎性细胞聚集、巨噬细胞游移、平滑肌增生等特点。近期研究表明，胆固醇结晶作为内源性分子能够激活炎性小体，促进动脉粥样硬化的发展[2]。动脉粥样硬化疾病严重威胁着人类的健康，本文将从炎性小体、胆固醇结晶与动脉粥样硬化三者的关系出发，为研究动脉粥样硬化抗炎症治疗提供新靶点。

1 NLRP3炎性小体概述

NLR(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)家族中NLRP3是最受关注的炎性小体，它是由NOD样受体蛋白3(Nod-likereceptor protein，NLRP3)、凋亡相关微粒蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein，ASC)和Caspase1组成的复合体。NLRP3是炎性小体的核心，由中心核苷酸寡聚结构域、C端亮氨酸重复结构域、N端热蛋白结构域三部分构成。NLRP3在被多种刺激因素激活后形成巨大的蛋白复合体即炎性小体，活化Caspase1(即IL-1β转化酶)，进而促进炎症因子IL-1β和IL-18剪切成熟和分泌，发挥炎症效应[3]。NLRP3炎性小体功能的发挥受到其自身结构的影响。近来研究发现，Caspase募集结构域蛋白8(Caspase recruitment domain-containing protein 8，CARD8)与Caspase1相互作用而对NLRP3炎性小体起负调控作用[4]。炎性小体的活性也与翻译后修饰调控的水平相关，去泛素化酶BRCC3能促进NLRP3的C端亮氨酸重复结构域去泛素化而活化炎性小体[5]；而NLRP3磷酸化则会抑制ASC形成。

2 NLRP3炎性小体激活机制

炎性小体在多种固有免疫细胞及组织中表达。研究表明，NLRP3炎性小体在静息细胞中表达水平较低，被双信号激活后而发挥生物学效应[6]。启动信号是由TOLL样受体或细胞因子受体介导，通过活化核因子NF-κB(Nuclear factor-kappa，NF-κB)途径上调NLRP3基因表达[7]。激活信号来自细菌或病毒核酸、代谢性刺激物如尿酸盐结晶、β-淀粉样蛋白等多种外源性或内源性分子。NLRP3炎性小体能被多种化学结构不同的物质激活，但是，目前尚未证实这些配体能直接结合NLRP3炎性小体，其识别物质的多样性提示NLRP3炎性小体与激动剂并不直接相互作用。目前研究认为激活NLRP3炎性小体机制主要包括3种：(1)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产生：线粒体来源的活性氧是调节NLRP3炎性小体活化的关键信号[8]。线粒体产生的硫氧化还原蛋白(Thioredoxin-interacting protein，TXNIP)能够激活表达于心脏微血管内皮细胞的NLRP3炎性小体[9]。(2)溶酶体降解：胆固醇结晶经吞噬细胞内吞作用进入胞内，降低溶酶体膜的稳定性，使溶酶体内容物组织蛋白酶B进入细胞质，促进NLRP3炎性小体的活化[2，16]。(3)钾离子外流：细胞内低钾浓度促进炎性小体的组装与活化，有研究认为，钾离子外流是NLRP3炎性小体激活的共同通路[10]。

以上激活炎性小体的机制并不是单独发挥作用，而是通过相互作用或者存在共同通路共同促进NLRP3炎性小体的激活。炎性小体的激活和调节受多种因素的影响，钙敏感受体[11]、鸟苷酸结合蛋白5[12]和双链RNA依赖的蛋白激酶[13](Double-stranded RNA-activated protein kinase，PKR)及miR223[14]等在其中发挥了重要作用。

3 胆固醇结晶与NLRP3炎性小体

动脉粥样硬化疾病危险因素如高胆固醇、高血糖、高甘油三酯等会导致血管内皮细胞和平滑肌细胞线粒体损伤，使活性氧产生过多、氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein，oxLDL)增加，对动脉内膜造成功能性损伤，更多的巨噬细胞通过CD36受体吞噬oxLDL转变为泡沫细胞，促进动脉粥样硬化的发展[15]。胆固醇结晶存在于动脉粥样硬化基本病变脂纹、纤维斑块到复杂病变的各个阶段，被认为是动脉粥样硬化的病变标志。Duewell等[2]利用新的观察技术发现微小的胆固醇结晶出现于动脉粥样硬化斑块形成早期，并与早期阶段浸润的炎症细胞同时出现，能激活NLRP3炎性小体，介导Caspase1活化和成熟IL-1β大量释放。他们推测，胆固醇结晶作为内源性分子激活NLRP3炎性小体促进动脉粥样硬化的发展。Rajamaki等[16]的研究结果进一步证实NLRP3炎性小体的激活依赖于胆固醇结晶介导的K+外流和溶酶体降解。胆固醇结晶与NLRP3炎性小体在动脉粥样硬化疾病中的相互作用引起了极大的关注，为探究其中的机制，许多学者进行了深入的研究。在AS中，内质网应激在泡沫细胞积聚的胆固醇结晶的诱导下通过未折叠或错误折叠蛋白的积聚来激活炎性小体[17]。除此之外，胆固醇调控元件结合蛋白2(Sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2)参与胆固醇生物合成及LDL摄取以维持胆固醇体内的平衡，但是，当SREBP2表达增强与高血脂协同作用时，可激活炎性小体引起内皮细胞功能紊乱，促进动脉粥样硬化斑块的形成[18]。动脉粥样硬化斑块形成的重要环节包括内皮细胞的活化及炎性细胞的募集，内皮细胞的活化是炎性细胞募集的先决条件，有研究发现，胆固醇结晶是通过补体系统活化内皮细胞[19]，进一步促进NLRP3炎症小体的激活和炎症因子的释放。因此，胆固醇结晶在AS早期即发挥重要作用，也是炎性小体的主要激活物，是否还有其他相关信号如核内转录因子2 (NF-E2-related factor-2，Nrf2)[20]参与调控胆固醇结晶诱导的炎症小体激活，有待进一步深入研究。

4 NLRP3炎性小体与AS

AS是血管性病变，炎症反应在动脉粥样硬化疾病的发生发展中发挥着重要作用。早期的炎症反应起保护作用，炎症反应过度可引起组织损伤、粥样斑块不稳定、破裂甚至心血管突发事件。炎性小体作为炎症反应的核心，与动脉粥样硬化发病机理有着密切的关联。NLRP3炎性小体在AS斑块中高表达，并且，巨噬细胞内oxLDL参与NLRP3炎性小体的调控，提示NLRP3炎性小体可能参与介导AS炎性反应过程[2，15]。内皮细胞和巨噬细胞从血液中摄取的胆固醇，可形成微小胆固醇结晶，而胆固醇结晶导致的IL-1β升高完全依赖于NLRP3炎症小体的激活[2]。NLRP3炎性小体激活后活化Caspase1，促进炎症因子IL-1β、IL-18分泌和释放。IL-1β水平与动脉粥样硬化疾病严重程度相关[21]。IL-1 β促进其他细胞因子和趋化因子的合成和分泌，诱导巨噬细胞活化及淋巴细胞激活、血管平滑肌细胞迁移和增生，并增加细胞与细胞间的相互作用及促进细胞凋亡、胞外胆固醇的堆积。沉积的结晶进一步使巨噬细胞中溶酶体破裂和活性氧产生，活化NLRP3炎性小体。同时活化的Caspase1能介导单核巨噬细胞等受到病原体感染或内源性因素刺激后引起的细胞焦亡[22]，使巨噬细胞释放内容物组织金属蛋白酶，降低斑块的稳定性。上述机制形成正反馈，使得斑块面积增加及稳定性下降。动脉粥样硬化病变中显著增强的氧化应激反应、内质网应激与NLRP3炎症小体的相互作用也是斑块稳定性下降的原因。

为探究NLRP3炎性小体在AS中的作用，大量研究人员建立了NLRP3炎性小体与AS相关性的实验模型。高脂饮食的载脂蛋白E基因缺陷(Apolipoprotein E deficient，APOE-/-)的小鼠敲除Caspase1基因可以减弱动脉粥样硬化斑块的形成[23]。同样的，低密度脂蛋白受体缺陷的小鼠与NLRP3-，ASC-或者IL-1a/Iβ基因缺陷的小鼠骨髓进行重组，并给予高胆固醇饮食后，观察到动脉粥样硬化斑块面积明显减少，IL-18表达水平降低[2]。这表明NLRP3炎性小体参与动脉粥样硬化疾病的发生发展。但是随后Menu等[24]通过对各类(APOE-/-NLRP3-/-、APOE-/-ASC-和APOE-/-Caspas e-/-)基因双敲除小鼠的研究发现，各组间斑块面积、巨噬细胞浸润和斑块稳定性都没有显著性差异。目前，造成这两组实验结果不一致的原因尚不清楚，可能与实验模型处理因素有关。为进一步验证NLRP3炎性小体与AS的关系，Zheng等[25]运用慢病毒载体介导的RNA干扰技术对载脂蛋白E基因缺陷的小鼠进行处理，成功沉默NLRP3基因后发现炎症因子浸润和斑块内脂质积聚减少、组织金属蛋白酶表达降低，结果证明，抑制NLRP3炎性小体能稳定动脉粥样硬化斑块。

由此可见，NLRP3炎性小体的活化及相关炎症因子的释放与动脉粥样硬化的发生、发展、转归有着密切的联系。抑制NLRP3炎性小体能稳定动脉粥样硬化斑块，降低因不稳定斑块造成的心血管事件的风险，并对动脉粥样硬化疾病起保护作用。

5 抗炎性小体的治疗策略

NLRP3炎性小体是目前研究最广泛的炎性小体，动脉粥样硬化、糖尿病、痛风等各种炎症性疾病和自身免疫性疾病均有炎性小体的参与。以NLRP3炎性小体为靶点的抗炎症治疗是目前减轻疾病发生发展的重要治疗措施。Toldo等[26]的研究证明急性心梗老鼠模型腹腔内注射单克隆IL-1β IgG抗体，较对照组能明显改善收缩功能障碍、抑制心肌凋亡、限制心室扩张，表明抑制IL-1β能改善急性心梗后心肌重塑，抗IL-1β药物可能成为预防急性心梗并发心衰靶向目标。目前，抗IL-1β药物主要有阿那白滞素、康纳单抗、利纳西普三种，临床有效性均已得到证实。但是，Toldo等[26]的研究也证实抑制IL-1β并不能控制无菌性炎症反应的程度。提示仅仅通过抑制炎症因子来达到治疗疾病的效果是远远不够的。近来发现，在疾病发展的早期，以NLRP3炎症小体自身组分或激活机制为治疗靶点，不仅可以抑制炎症因子的释放，还能抑制细胞的凋亡及减轻组织的损伤。如小分子药物包括格力本、小白菊内酯、P2X7受体(Purinergic 2X7 receptor)拮抗剂AZD9056等[27]。新的研究发现，MCC950小分子对AIM2、NLRC4及NLRP1炎性小体没有抑制作用，但却能特异性抑制NLRP3激活，其作用的发挥与抑制ASC低聚化、Caspase-1依赖的细胞程序性死亡及IL-1α分泌有关[28]。而β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate，BHB)能抑制ATP诱导的Caspase1剪切及IL-1β的活化，抑制ASC低聚化及ASC形成，并且，BHB还可影响细胞内钾浓度，从而通过这条共同通路抑制激活物激活NLRP3炎性小体[29]。这些NLRP3炎症小体的小分子抑制剂将为治疗动脉粥样硬化等疾病提供广阔前景。

6 结语

动脉粥样硬化是一种慢性血管炎症性疾病，涉及低密度脂蛋白的氧化、血管内皮细胞损伤、氧化应激、高胆固醇血症等多种因素，其中血管内皮下脂质斑块的形成是动脉粥样硬化的标志。现有研究证实，胆固醇结晶、炎性小体及其之间的相互作用与动脉粥样硬化的发生发展有着密切的关联，这为动脉粥样硬化的预防及治疗提供了新的思路。胆固醇结晶活化炎性小体主要通过K+外流、活性氧产生、溶酶体破裂及线粒体损伤等激活机制，但是涉及其具体的分子机制以及是否存在其他通路还有待于进一步证实，影响炎症小体的组装和调控因素也不是很清楚，小分子抑制剂是否有明显的临床疗效，这些问题值得深入的探究。

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Roles of NLRP3 inflammasome and cholesterol crystals in the development of atherosclerosis.

LUO Cai-yun,DING Jia-wang,ZHENG Xia-xia,ZHOU Tian.The First College of Clinical Medical Science,China Three Gorges University,Department of Cardiology,the Central People's Hospital of Yichang,Yichang 443002,Hubei,CHINA

Atherosclerosis(AS)is the chronic inflammation of the blood vessel wall,which is associated with a variety of factors such as vascular endothelial dysfunction,inflammation and autoimmune.Recent studies have shown that the inflammasome is the core of the inflammatory response.Inflammasome,one of the innate immune pattern recognition receptors,can activate Cysteine aspartate-specific protease 1(Caspase 1)and promote the release of inflammatory cytokines,then participate in the development of many inflammatory diseases including atherosclerosis.Cholesterol crystals are the sign of atherosclerotic lesions.As one of endogenous substances,they can activate the NOD-like receptor protein 3(NLRP3)inflammasome and promote the development of atherosclerosis.For providing a new target for anti-inflammatory therapy,this article will focus on the roles of inflammasome and cholesterol crystals in the development of atherosclerosis.

NLRP3 inflammasome;Cholesterol crystals;Atherosclerosis

R543.5

A

1003—6350（2016）11—1837—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.11.037

2015-10-09)

湖北省自然科学基金（编号：2014CFC1035）

丁家望。E-mail：Dingjiawang@medmail.com.cn