热休克蛋白70在急性胰腺炎中的作用

洪育蒲 综述 王卫星 审校

(武汉大学人民医院普外科，湖北 武汉 430060)

·综 述·

热休克蛋白70在急性胰腺炎中的作用

洪育蒲 综述 王卫星 审校

(武汉大学人民医院普外科，湖北 武汉 430060)

热休克蛋白(HSPs)是广泛存在于生物体内的高度保守的一类应激蛋白。HSP对各种刺激具有迅速的反应能力，发挥抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡以及分子伴侣等作用，在细胞的生长发育、代谢分化、基因转录、维持组织细胞的自稳和环境适应性方面扮演着重要角色。而其中最受研究者关注的是HSP70，其在生理状态下少量表达，可通过热预处理、药物以及基因转染等方法诱导其产生，从而发挥细胞保护作用。本文就HSP70在急性胰腺炎中的作用以及相关机理的研究进展做一综述。

热休克蛋白；急性胰腺炎；机理

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是多种病因引起的胰腺内消化酶激活，导致胰腺组织自身消化的局部炎症反应，病情较重者可进展为全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，并可伴有其他器官功能改变，甚至发生多器官功能障碍综合征(MODS)，是常见的急腹症。

热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)广泛存在于人、动物、植物和微生物细胞中，是一类具有重要的生理功能和结构上高度保守的多肽类蛋白质分子家族[1]。HSP在蛋白质的合成、折叠、凝集、转运和降解起到重要的分子伴侣作用，在维持细胞的自稳和环境适应性等方面扮演着重要角色。机体遭受组织损伤、缺血、缺氧、病原微生物感染、炎症等均可引起细胞的应激反应，从而诱导HSP的表达，以维持细胞的正常生理功能，故又称应激蛋白[2]。其中HSP70是HSP家族中的重要成员，目前已知其结构上最为保守，在大多数生物细胞中含量最多，且在机体应激反应中最为敏感。近年来一系列研究发现，HSP70具有能保护细胞免受刺激损伤，促进受损细胞自身进行修复以及抗炎等作用，在急性胰腺炎保护中发挥着重要作用。现就HSP70在急性胰腺炎中的保护作用的研究进展予以综述。

1 HSP70概述

1.1 HSP70的分类及结构 HSP70家族主要包含4类蛋白质[3]：(1)诱导型HSP70，又称HSP72，存在于细胞核，在正常细胞内表达较少，其表达在细胞受到应激原刺激后迅速增加，HSP70.1是编码它的主要基因之一；(2)结构型HSP70，即HSC70(Heat shock cognate protein 70)又称HSP73，存在于胞浆，是在哺乳动物所有细胞内均能表达的结构蛋白，发生应激后仅有少量增加；(3)葡萄糖调节蛋白75(Glucose regulated protein 75，GRP75)，是位于线粒体内的分子伴侣，参与调控线粒体稳态和致癌作用，又称为死亡蛋白(Mortalin)[4]；(4)葡萄糖调节蛋白78(GRP78)，是位于内质网的伴侣蛋白，参与调控钙稳态与细胞凋亡，又称为免疫球蛋白重链结合蛋白(Immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP)。其中，HSP72和HSP73具有高度的序列同源性和相似的生物化学特性。

HSP70蛋白的一级结构可分为3个功能域[5]：近N端为高度保守的氨基酸序列，分子量约44 kDa，为核苷酸结合域(Nucleotide biding domain，NBD)，具有ATP酶活性，其保守性比羧基端更高，与不同生物的HSP70所共有的生化特性有关；紧接着为保守的氨基酸序列，分子量约16 kDa，为多肽结合功能域(Polypeptide biding domain，PBD)；近C端包含有结构不明确的氨基酸序列，分子量约10 kDa，参与特定的蛋白底物相互作用。

1.2 HSP70的生物学特性及合成 HSP70家族具有以下生物学特性：(1)所有HSP70的ATP亲和性较高，ATP酶活性较弱，NBD与ATP结合后发生构象改变促使蛋白底物与PBD解离，ATP-HSP70对靶蛋白的亲和性更高，形成HSP70蛋白复合体后稳定结合[6]；(2)其他HSP或细胞因子对HSP70蛋白复合体的形成起到辅助作用[7]；(3)在蛋白稳定构象的形成、运输或降解过程中，HSP70需选择性结合某些多肽或特殊蛋白；(4)HSP70家族具有结构上高度保守的钙调素结合域，保护靶蛋白不被降解[8]。

HSP70的合成主要受热休克转录因子(Heat shock transcription factor 1，HSF1)的调控。在无应激状态下，HSF1以单体形式与HSP70结合形成复合物而使得活性受到抑制。当细胞受到刺激，细胞内的变性蛋白增加时，HSF1单体从复合物上解离形成三聚体使得HSF1能够转位到核内，在核内HSF1通过其丝氨酸残基的磷酸化结合到HSP基因上的启动子热休克元件上，从而激活HSP的转录及后续的翻译过程[9-10]。

2 HSP70在急性胰腺炎中的作用

Frossard等[11]研究表明用电热垫将大鼠体温升高至42℃维持20 min，可以诱导胰腺内HSP70表达增加，防止超大剂量蛙皮素引起的胰腺腺泡损伤，阻止胰蛋白酶原活化与胰蛋白酶激活肽(TAP)产生。此外，HSP70在精氨酸和牛磺胆酸钠诱导的急性胰腺炎动物模型中也有保护作用[12-13]。

Bhagat等[14]应用HSP70反义引物注射到大鼠体内，热应激诱导的HSP70表达受到抑制，超大剂量蛙皮素刺激得以恢复激活胰腺内胰蛋白酶原的能力，淀粉酶(AMY)和TAP水平升高，使得热应激预处理失去保护作用，同时在未经热应激预处理的大鼠中，HSP70反义引物加剧了胰腺炎的严重程度。并且进一步以热休克因子-1(HSF-1)敲除和HSP70过表达转基因小鼠来证明HSP70的保护作用[15]，HSF-1敲除小鼠胰腺炎程度较野生型小鼠严重，HSP70过表达转基因小鼠胰腺炎得到缓解。Hwang等[16]报道，在蛙皮素注射前，HSP70.1基因敲除小鼠与野生型小鼠相比，前者胰蛋白酶基础活性、酶原与溶酶体的组织蛋白酶B比例均增高，进而可自发性发生胰蛋白酶原激活。由亚砷酸钠诱导的HSP70在大鼠胰腺内高效表达，缓解了蛙皮素和精氨酸诱发的急性胰腺炎损伤[17]。Meng等[18]用 42℃生理盐水腹腔灌洗30 min作为热应激诱导HSP70在胰腺内高表达，明显降低血清AMY、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)及TAP水平，使得胰腺组织损伤减轻。

3 HSP70在急性胰腺炎中的作用机理

目前，大量研究支持HSP70在胰腺炎发生发展过程中发挥着重要的保护作用，但是具体机理尚未完全阐明。现有研究认为HSP70主要通过以下两种机理发挥胰腺保护作用。

3.1 抑制溶酶体酶和消化酶原的共区域化 在正常条件下，消化酶原和溶酶体水解酶均在腺泡细胞粗面内质网合成，分别经高尔基体各自形成分泌泡并转运至相应的消化酶原颗粒和溶酶体中。Steer等[19]首次发现在胰腺炎中，胰腺内的消化酶和溶酶体水解酶发生转运障碍。两种酶同时出现在细胞内的吞噬囊泡中，当囊泡破裂时，活化的胰酶释放，造成胰腺自我消化和胰腺炎的发生。有研究表明，HSP70可以阻止溶酶体组织蛋白酶B和消化酶原的共区域化，削弱腺泡细胞的酶原活化，减轻胰腺炎程度[16]。此前，Rakonczay等[20]报道热应激预处理诱导的HSP70表达，不能对胰腺内直接注射胰蛋白酶诱导的坏死性胰腺炎发挥保护作用，提示HSP一定程度上是通过阻碍胰酶活化而使胰腺炎缓解。

有研究者在细胞实验中发现，缩胆囊素诱导的溶酶体组织蛋白酶B再分布和酶原活化依赖于钙离子浓度的病理性上升，螯合细胞内的钙离子可阻止共区域化的发生[21-22]。这提示HSP70可能通过调节细胞内钙离子稳态，干扰引起酶原活化和胰腺炎发生的细胞内蛋白转运过程。

胰蛋白酶原的活化还与自噬的发生有关[23-26]。LC3B-Ⅱ是自噬小体的通用标记物，自噬发生时，LC3B-Ⅱ的表达与自噬小泡水平的增加相对应[27]。HSP70水平的升高可以显著抑制胰腺炎大鼠LC3B-Ⅱ的表达，并减少胰腺腺泡细胞自噬小体和自噬溶酶体的生成[28]。进一步研究表明，HSP70可通过Akt-mTOR途径发挥对自噬的抑制作用，HSF1表达减少使得自噬的基础水平增加。HSP70活化蛋白激酶Akt，使得mTOR(Mammalian target of rapamycin，哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白)发生磷酸化，磷酸化的mTOR与衔接蛋白RAPTOR结合形成复合体mTORC1[29]。mTORC1不仅可以抑制自噬的表达，还参与了HSF1的活化，进而促进HSP70的表达[30]，降低了胰蛋白酶活性而减轻胰腺炎损伤程度。

3.2 下调NF-κB，限制炎症介质产生 NF-κB是一种多功能核转录因子，可以通过调节许多炎症因子(TNF-α，IL-1，IL-6，IL-8)来作用于炎症反应，而这些炎症因子又可以反过来激活NF-κB，形成一个正反馈。在静息细胞中，NF-κB与抑制因子IκBα结合形成无活性的复合体而存在于胞浆中，当细胞受外来刺激时，IκBα被IκB激酶(IKK)磷酸化，继而经泛素化途径降解，使得NF-κB的核转位信号暴露并移位至细胞核内与亲和力高的DNA序列结合，激活下游靶基因的转录[31]。由于IκBα基因的转录启动区包含3个NF-κB结合位点，在NF-κB激活的同时，IκBα也被诱导而大量表达，并与NF-κB结合，从而终止NF-κB活化，这构成了NF-κB激活的负反馈途径[32]。

Altavilla等[33]研究表明，在急性胰腺炎早期阶段，胰腺释放的TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8等炎症介质的异常反应不仅造成胰腺局部损伤，还会引起一系列“瀑布式”级联效应，甚至发生SIRS和MODS[34]。Long等[35]报道，NF-κB在胰腺炎发生时迅速被激活，在NF-κB基因敲除小鼠胰腺炎模型中，胰腺炎严重程度显著降低。Baumann等[36]在IKK2组成激活与IKK2显性失活的转基因小鼠中应用蛙皮素诱导急性胰腺炎，发现IKK2显性失活的小鼠胰腺局部炎症较野生型小鼠明显减轻，IKK2组成激活的胰腺炎小鼠的TNF-α、IL-1及ICAM-1水平较野生型小鼠明显升高，但蛙皮素诱导的离体腺泡内胰酶活化在两组转基因小鼠之间没有显著差异。Ji等[37]在细胞实验中发现细胞内活化的胰蛋白酶不能激活NF-κB及其下游炎症介质的释放，而外源性胰蛋白酶可显著增强腺泡细胞的NF-κB活性。以上研究提示腺泡细胞内胰蛋白酶原活化与NF-κB激活在胰腺损伤时可能是两个相对独立的过程。此外，Frossard等[38]发现HSP70在高热预处理的胰腺细胞中高表达，与此同时NF-κB活化延迟。Zhu等[39]研究表明，42℃生理盐水连续腹腔灌洗可以诱导大鼠胰腺表达HSP70增加，降低血清TNF-α及IL-8水平。转基因小鼠过表达HSP72可以通过减弱NF-κB通路信号，加快胰腺组织损伤修复[40]。因此，一些研究者认为HSP70可能通过下调NF-κB活性来限制炎症因子的产生，减少了炎症因子对NF-κB的正反馈激活，进而减轻胰腺炎病情。

HSP主要通过以下途径抑制NF-κB的活性：首先，热休克反应可以降低IκB/NF-κB通路上游的NF-κB诱导激酶、IL-1受体相关激酶的溶解性，进而抑制IKK的激活，并增加细胞内磷酸酶的活性，进而降低IκBα的磷酸化水平，抑制IκBα的降解[41]。其次，IκBα的启动子内含有热休克元件，使得IκBα基因的转录与HSP基因同时进行，且热休克反应在后转录水平也促进IκBα基因的表达[42]。此外，HSP可竞争性抑制NF-κB经核孔复合体进入细胞核内[43]。HSP70亦可促进核内NF-κB亚单位p65蛋白的降解来抑制NF-κB促炎信号[44]，阻碍胰腺炎的发生发展。

4 结 语

综上所述，HSP70作为一种重要的细胞保护因子，其表达增加可抑制胰蛋白酶原活化与限制炎症级联反应，减少胰腺腺泡坏死及全身炎症反应的发生，从而缓解急性胰腺炎的病情进展。

目前关于HSP70在急性胰腺炎及其他炎症发生发展过程中的作用的研究大多集中在离体细胞和动物实验中，在人体上的研究很少。HSP70在急性胰腺炎的作用机制仍有待进一步阐明，为开发应用非毒性药物或基因工程等手段诱导HSP70表达发挥脏器保护作用提供新的途径。

[1]Borges TJ,Wieten L,Van Herwijnen MJC,et al.The anti-inflammatory mechanisms of Hsp70[J].Front Immunol,2012,3:95.

[2]Lindquist S.The heat-shock response[J].Annu Rev Biochem,1986, 55:1151-1191.

[3]Welch WJ.Mammalian stress response:cell physiology,structure/ function of stress proteins,and implications for medicine and desease [J].Physiol Rev,1992,72(4):1063-1081.

[4]Amick J,Schlanger SE,Wachnowsky C,et al.Crystal structure of the nucleotide-binding domain of mortalin,the mitochondrial Hsp70 chaperone[J].Protein Science,2014,23(6):833-842.

[5]Michelini ET,Flynn GC.The unique chaperone operon of thermotoga maritima:Cloning and initial characterization of a functional Hsp70 and small heat shock protein[J].Journal of Bacteriology, 1999,181(14):4237-4244.

[6]Mayer MP.Gymnastics of molecular chaperones[J].Molecular Cell, 2010,39(3):321-331.

[7]Kampinga HH,Craig EA.The HSP70 chaperone machinery:J proteins as drivers of functional specificity[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2010,11(8):579-592.

[8]Rh B.Heat shock proteins in relation to medicine[J].Molecular Aspects of Medicine,1993,14(2):83-165.

[9]Ortner V,Ludwig A,Riegel E,et al.An artificial HSE promoter for efficient and selective detection of heat shock pathway activity[J]. Cell Stress Chaperones,2015,20(2):277-288.

[10]Powers MV,Workman P.Inhibitors of the heat shock response:biology and pharmacology[J].FEBS letters,2007,581(19):3758-3769.

[11]Frossard JL,Bhagat L,Lee HS,et al.Both thermal and non-thermal stress protect against caerulein induced pancreatitis and prevent trypsinogen activation in the pancreas[J].Gut,2002,50(1):78-83.

[12]Rakonczay Z,Takacs T,Ivanyi B,et al.The effects of hypo-and hyperthermic pretreatment on sodium taurocholate-induced acute pancreatitis in rats[J].Pancreas,2002,24(1):83-89.

[13]Tashiro M,Ernst SA,Edwards J,et al.Hyperthermia induces multiple pancreatic heat shock proteins and protects against subsequent arginine-induced acute pancreatitis in rats[J].Digestion,2002,65(2): 118-126.

[14]Bhagat L,Singh VP,Song AM,et al.Thermal stress-induced HSP70 mediates protection against intrapancreatic trypsinogen activation and acute pancreatitis in rats[J].Gastroenterology,2002,122(1):156-165.

[15]Bhagat L,Van Acker GJ,Manzoor R.Targeted deletion of heat shock factor(HSF-1)exacerbates the severity of secretagogue-induced pancreatitis[J].Pancreas,2002,25:421-426.

[16]Hwang JH,Ryu JK,Yoon YB,et al.Spontaneous activation of pancreas trypsinogen in heat shock protein 70.1 knock-out mice[J].Pancreas,2005,31(4):332-336.

[17]Bhagat L,Singh VP,Dawra RK,et al.Sodium arsenite induces heat shock protein 70 expression and protects against secretagogue-induced trypsinogen and NF-kappaB activation[J].J Cell Physiol, 2008,215(1):37-46.

[18]Meng K,Liu QS,Dou Y,et al.Prior peritoneal lavage with hot 0.9% saline induces HSP70 expression and protects against cerulein-induced acute pancreatitis in rats[J].Mol Biol Rep,2013,40(2): 1443-1449.

[19]Steer ML,Meldolesi J,Figarella C.Pancreatitis.The role of lysosomes[J].Dig Dis Sci,1984,29(10):934-938.

[20]Rakonczay Z,Takacs T,Ivanyi B,et al.Induction of heat shock proteins fails to produce protection against trypsin-induced acute pancreatitis in rats[J].Clin Exper Med,2002,2(2):89-97.

[21]Petersen OH.Ca2+-induced pancreatic cell death:roles of the endoplasmic reticulum,zymogen granules,lysosomes and endosomes[J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology,2008,23 Suppl 1: S31-S36.

[22]Raraty M,Ward J,Erdemli G,et al.Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2000,97(24):13126-13131.

[23]Xu B,Bai B,Sha S,et al.Interleukin-1beta induces autophagy by affecting calcium homeostasis and trypsinogen activation in pancreatic acinar cells[J].International Journal of Clinical and Experimental Pathology,2014,7(7):3620-3631.

[24]Gukovsky I,Pandol SJ,Mareninova OA,et al.Impaired autophagy and organellar dysfunction in pancreatitis[J].Journal of Gastroenterology and Hepatology,2012,27(Suppl 2):27-32.

[25]Ohmuraya M,Yamamura K.Autophagy and acute pancreatitis:a novel autophagy theory for trypsinogen activation[J].Autophagy,2008, 4(8):1060-1062.

[26]Hashimoto D,Ohmuraya M,Hirota M,et al.Involvement of autophagy in trypsinogen activation within the pancreatic acinar cells[J]. The Journal of Cell Biology,2008,181(7):1065-1072.

[27]Barth S,Glick D,Macleod KF.Autophagy:assays and artifacts[J].J Pathol,2010,221(2):117-124.

[28]Kim JN,Lee HS,Ryu SH,et al.Heat shock proteins and autophagy in rats with cerulein-induced acute pancreatitis[J].Gut Liver,2011,5 (4):513-520.

[29]Dokladny K,Zuhl MN,Mandell M,et al.Regulatory coordination between two major intracellular homeostatic systems:heat shock response and autophagy[J].J Biol Chem,2013,288(21):14959-14972.

[30]Chou SD,Prince T,Gong JL,et al.mTOR is essential for the proteotoxic stress response,HSF1 activation and heat shock protein synthesis[J].PLoS One,2012,7(6):9.

[31]Hinz M,Arslan SC,Scheidereit C.It takes two to tango:IkappaBs, the multifunctional partners of NF-kappaB[J].Immunological Reviews,2012,246(1):59-76.

[32]Moss BL,Elhammali A,Fowlkes T,et al.Interrogation of inhibitor of nuclear factor kappaB alpha/nuclear factor kappaB(IkappaBalpha/ NF-kappaB)negative feedback loop dynamics:from single cells to live animals in vivo[J].The Journal of Biological Chemistry,2012, 287(37):31359-31370.

[33]Altavilla D,Famulari C,Passaniti M,et al.Attenuated cerulein-induced pancreatitis in nuclear factor-kappa B-deficient mice[J].Lab Invest,2003,83(12):1723-1732.

[34]Bhatia M.Acute pancreatitis as a model of SIRS[J].Frontiers in Bioscience,2009,14:2042-2050.

[35]Long J,Song N,Liu XP,et al.Nuclear factor-kappaB activation on the reactive oxygen species in acute necrotizing pancreatitic rats[J]. World J Gastroenterol,2005,11(27):4277-4280.

[36]Baumann B,Wagner M,Aleksic T,et al.Constitutive IKK2 activation in acinar cells is sufficient to induce pancreatitis in vivo[J].The Journal of Clinical Investigation,2007,117(6):1502-1513.

[37]Ji B,Gaiser S,Chen X,et al.Intracellular trypsin induces pancreatic acinar cell death but not NF-kappaB activation[J].The Journal of Biological Chemistry,2009,284(26):17488-17498.

[38]Frossard JL,Pastor CM,Hadengue A.Effect of hyperthermia on NF-kappa B binding activity in cerulein-induced acute pancreatitis[J]. Am J Physiol-Gastroint Liver Physiol,2001,280(6):G1157-G1162.

[39]Zhu L,Cheng S,Qin Y,et al.Influence of peritoneal lavage with warm saline on HSP70 expression in rat pancreas[J].Hainan Med J, 2013,24(16):2341-2343.

[40]Lunova M,Zizer E,Kucukoglu O,et al.Hsp72 overexpression accelerates the recovery from caerulein-induced pancreatitis[J].PLoS One,2012,7(7):e39972.

[41]Lee KH,Hwang YH,Lee CT,et al.The heat-shock-induced suppression of the IkappaB/NF-kappaB cascade is due to inactivation of upstream regulators of IkappaBalpha through insolubilization[J].Experimental Cell Research,2004,299(1):49-56.

[42]Wong HR,Dunsmore KE,DenenbergAG.Transcriptional and post-transcriptional regulation of I kappa B alpha gene expression by heat shock[J].Crit Care Med,2000,28(12):A38.

[43]Wu L,Hu C,Huang M,et al.Heat shock transcription factor 1 attenuates TNFalpha-induced cardiomyocyte death through suppression of NFkappaB pathway[J].Gene,2013,527(1):89-94.

[44]Tanaka T,Shibazaki A,Ono R,et al.HSP70 mediates degradation of the p65 subunit of nuclear factor kappa B to inhibit inflammatory signaling[J].Sci Signal,2014,7(356):ra119.

Research progress of heat shock protein 70 in acute pancreatitis.

HONG Yu-pu,WANG Wei-xing.Department of General Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

Heat shock proteins(HSPs)are a highly conserved group of stress proteins which exist in virtually all known organisms.HSPs possess rapid reactive potency to all kinds of stimulus,and have effects on anti-inflammation,anti-oxidation,anti-apoptosis,as well as molecular chaperones.These proteins play an essential role in a variety of cellular activities including cell growth and development,metabolism and differentiation,gene transcription,intracellular homeostasis and environmental adaptability.HSP70 is attracting the most attention among HSPs,which express at a lower degree in physiological condition than induced by prior thermal stress,drug,gene transfection,and consequently exert cytoprotection.Research progresses of HSP70 about its effects and related mechanisms in acute pancreatitis were reviewed in this article.

Heat shock proteins;Acute pancreatitis;Mechanism

R657.5+1

A

1003—6350（2016）11—1823—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.11.033

2015-11-16)

国家自然科学基金(编号：81370562、81300356)

王卫星。E-mail：sate.llite@163.com