中药抗阿尔茨海默病的研究进展

胡艳秋，苏 瑾，田 鸣

(1.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯市中心医院，黑龙江 佳木斯 154002)



中药抗阿尔茨海默病的研究进展

胡艳秋1，苏 瑾1，田 鸣2

(1.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯市中心医院，黑龙江 佳木斯 154002)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease ，AD)是全世界范围内常见的中老年人神经退行性疾病之一。近年来，AD发病率逐渐升高，对社会和患者家庭造成了沉重的负担，迫切需要开发新药来对抗AD。因AD的发病机制具有不确定性和复杂性。最近几十年来，研究人员对从中草药中分离出活性成分，并对这些成分预防与治疗AD的功效进行了研究与比较。一些黄酮类，生物碱类，苯丙素类，三萜皂甙，生物碱类等成分被证实对AD存在潜在功效。本文总结了这些活性成分治疗AD的疗效及其作用机制。

抗AD；中药提取物；研究进展

阿尔茨海默病(Alzheimer disease ，AD)是中老年人神经退行性疾病之一，特点是进行性记忆丧失和认知功能障碍，其特征是大脑的活动和功能持续的神经紊乱。AD是全球引起死亡的第六大原因[1]。据统计，AD患者的数量估计在3600万左右，到2050年将增至3倍。目前，在AD患者估计为900万，60岁以上的老人患病率为2.43 %。对社会和患者家庭造成了沉重的负担，迫切需要开发新药来抗AD，但是目前仍缺乏有效治疗AD的方法。中医药以整体观、多靶点和“辨证施治”为特色，在研究老年痴呆这一全身性疾病方面表现出一定优势，在AD的预防、中西药协同治疗等方面积累了一些经验。现将近年有关中医药治疗老年痴呆的情况综述如下。

1 阿尔茨海默病的致病机制

AD的发病原因可能与老龄化、遗传因素、神经递质障碍、细胞骨架改变、氧化应激、细胞凋亡、炎性/免疫反应有关。具体发病机制目前尚未完全研究透彻，只是存在多种假说[2]，包括胆碱能神经元假说、Aβ毒性假说、Tau 蛋白假说、胰岛素假说、自由基损伤假说。在AD患者的胆碱能神经元系统中有特异性神经递质缺陷，胆碱能神经元明显受损，特别是皮质和海马、前脑Meynert 基底核和隔区等部位。这些脑区的乙酰胆碱基转移酶(CHAT)和乙酰胆碱酯酶( AchE)活性降低，胆碱能系统活性下降，引起脑中乙酰胆碱(Ach) 浓度减少。大量的动物实验和临床证明，胆碱能系统和记忆、学习能力密切有关。因此，胆碱能系统的改变与AD的认知功能损害程度密切相关，即“胆碱能假说”[3]。

Aβ是指β-淀粉样蛋白，它在AD的发生发展中起到了关键作用，在AD患者中发现Aβ的沉积，其会损坏周围神经细胞膜和线粒体膜，导致神经细胞的损伤，引起乙酰胆碱的合成与释放量减少，兴奋在神经细胞间的传递速度减慢，表现为记忆障碍。即“Aβ毒性假说”[4]。

在体内Aβ与Tau结合形成可溶性稳定复合物，这种结合可以促进老年斑和神经纤维缠结的聚集。更重要的是，Aβ和Tau的存在可引起Tau快速解离以及轴索结构的崩解，会导致突触的功能障碍并最终导致神经元细胞死亡。即“Tau蛋白假说”[5]。据欧美流行病学调查显示，60岁老年人群中有近一半的老人存在胰岛素抵抗。但有关研究发现, 与健康人群对照，AD患者脑脊液的胰岛素水平及胰岛素介导的糖代谢都是降低的。

由于AD 的发病机理可能是多因素的，因此中药在抗阿尔茨海默病(AD)中发挥了至关重要的作用，有研究显示中草药中的活性成分对阿尔茨海默症(AD)有很好的预防及治疗效果。AD的治疗是一个具有挑战性的课题, 若要取得突破性进展，有赖于对AD 发病机理的深入研究。

2 治疗药物

在最近几十年中，中药天然产物被发现在治疗AD中有很好的疗效。如减少Aβ的聚集，清除自由基，抑制神经细胞的凋亡，提高胆碱能神经元的功能等。一些黄酮类，生物碱类，苯丙素类，三铁皂苷类，多糖类等被证明有抗AD的疗效。

2.1 黄酮类

黄酮类化合物广泛存在于自然界，最常见的活性就是抗氧化活性。这类化合物的许多生物活性在临床中也被展现出来，如对心脑血管的作用，抗炎作用，抗菌及抗病毒作用，雌性激素样作用等。黄酮的这些生物活性构成了抗AD的基础。其中银杏黄酮，大豆异黄酮，葛根素，银杏都表现出良好的效果[6]。

2.1.1 葛根素

葛根素是一种从豆科植物中提取的二氢异黄酮苷，具有扩张血管、降血脂和降低血压、改善微循环、抗氧化、抗血栓等作用。目前在中国用于治疗缺血性脑血管疾病和其他血管功能障碍。研究发现[6]，葛根素在由东莨菪碱或D-半乳糖诱导的小鼠模型中对学习和记忆障碍有潜在的影响。有报道称[7]葛根素可减少Aβ的生成，因此可以缓解患病动物的学习和记忆障碍。葛根素的抗AD效果也关系到它降低脂质过氧化物酶的含量，增加脑组织中超氧化物歧化酶的水平，增强脑血流量，并改善大脑微循环[7]。

2.1.2 银杏

银杏黄酮类化合物提取物中的主要成分银杏(EGB)，银杏在临床上用于治疗AD。前期研究发现，它可以体外抑制Aβ的寡聚化，保护神经元免受Aβ毒性，提高 AD模型小鼠的认知能力。Tchantchou 等[9]采用复合转基因小鼠模型 TgAPP/PS1，观察银杏对神经再生的影响。结果发现银杏能明显促进青年(6月龄)和衰老(22月龄)TgAPP/PS1小鼠海马区细胞增殖，另外可以减轻小鼠海马区Aβ的寡聚化。这些结果表明，银杏可以促进神经发生，这一现象有益于AD 的预防和治疗。银杏在治疗AD中有清除自由基的作用，抑制脂质过氧化。目前，在中国，法国和德国银杏叶提取物作为医疗药物治疗AD[8]。

2.1.3 大豆异黄酮

大豆异黄酮(SIF)是天然植物大豆的提取物，与雌激素结构相似，具有类雌激素作用。研究发现SIF可改善阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆能力，降低海马组织早老素1的表达，减少载脂蛋白E4的含量，减少海马神经细胞丢失，影响一氧化氮-环鸟苷酸信号转导系统[9]。

动物研究表明，大豆异黄酮能够提高学习和记忆能力是通过影响大脑胆碱能系统和减少神经元的丢失尤其是在雌性大鼠中。临床研究表明绝经后的AD妇女与没有绝经的AD妇女相比雌激素治疗后风险低。另一组随机，双盲，交叉，和安慰剂对照试验表明，大豆异黄酮是安全的并对认知功能有积极的影响，尤其是绝经AD妇女中的语言记忆能力。大豆异黄酮可降低Aβ的表达，拮抗Aβ的毒性并减少其沉积，保护神经细胞不受Aβ的侵害，促进基底前脑核及其投射区ChAT活性增加，可以促进ACh的合成。SIF可能通过影响ACh的代谢，增加ACh的表达，从而起到治疗AD的作用[10]。

2.1.4 甘草苷

甘草苷(LQ)是甘草根的提取物，LQ具有潜在的抗阿尔茨海默病作用，其机制可能与拮抗Aβ25-35的细胞毒性(减少细胞凋亡、拮抗细胞内钙离子超载、降低细胞内活性氧升高程度)、选择性抑制乙酰胆碱酯酶和促进M1胆碱受体表达、抑制由NF-KB介导的炎症和增强神经生长因子的神经营养作用有关，杨等人调查甘草苷对原代培养的大鼠海马神经元有保护作用。他们发现，用甘草苷预处理6小时能降低细胞内钙离子浓度和由Aβ25-35引起的神经元的细胞凋亡。甘草苷也能够提高神经生长因子的影响延长神经轴突。值得一提的是甘草苷还可以特异性抑制乙酰胆碱酯酶的活性，促进神经干细胞分化为胆碱能神经元。神经保护和神经营养作用使甘草苷对治疗AD有很好的前景[11]。

2.2 苯丙素类

天然成分中有一类苯环与三个直链碳连在一起为单元(C6-C3)构成的化合物，统称为苯丙素类。从生物合成途径来看，它们多数由莽草酸通过苯丙氨酸和酪氨酸等芳香氨基酸，经脱氨、羟基化、偶合等反应步骤形成最终产物。它们具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等活性。其中姜黄素、丹参酮、五味子等用于治疗AD。

2.2.1 姜黄素

姜黄在南亚是一种特别知名的烹饪药草，是厨房里必不可少的食材。姜黄素就是从其中分离出的活性成分。近年来研究表明，姜黄素有抗炎，抗肿瘤，抗AD，抗氧化等作用。姜黄素抗AD的作用机制包括以下几个方面：(1)姜黄素能有效抑制Aβ的形成。研究发现姜黄素与纤维状Aβ有较高的亲和性，能与纤维状Aβ结合，使Aβ失去稳定性进而降解。姜黄素还对Aβ的聚集有抑制作用，并可清除Aβ。(2)姜黄素具有很好的抗氧化作用。 研究表明姜黄素由于其抗氧化活性能保护神经细胞PC12和由Aβ42造成损伤的细胞。另一项研究表明用10μg/mL姜黄素预处理的PC12细胞能降低抗氧化酶的水平，保护由Aβ25-35 造成损伤的DNA。(3)姜黄素能抑制乙酰胆碱酯酶的活性。在体外研究中，姜黄素抑制乙酰胆碱酯酶的活性IC 50值为67.69 μM。这表明姜黄素在抗AD上起到了很好的作用，也是开发中药治疗AD不可或缺的天然产物[12]。

2.2.2 阿魏酸

Ji jing Yan等人[13]研究了阿魏酸的淀粉样前体蛋白对早老素1(PS1)转基因阿尔兹海默症造模小鼠的作用。长期口服给药阿魏酸(给药6个月，年龄从6～12个月)，剂量5.3mg/kg·d，显著增强了小鼠的特异性识别功能，并且降低了额叶皮质中淀粉样蛋白沉积和白细胞介素-1β(1L-1β)的水平。这些结果表明，阿魏酸在一定剂量可能是用于预防和治疗阿尔茨海默症。值得用于临床研究中的AD患者。

2.2.3 五味子酮

五味子酮是从五味子中分离出来的木脂素。研究发现[14]，五味子酮能够清除超氧阴离子自由基和其他ROS ，包括过氧化氢和黄嘌呤 - 黄嘌呤氧化酶系统所产生的-OH并降低了产生MDA的脂质过氧化过程。此外，华中五味子酮能显著抑制由Aβ产生的氧化应激和膨胀炎性反应。此外，华中五味子酮抑制由Aβ引起的细胞内钙浓度升高，从而保持细胞内钙的稳态平衡，保护神经元凋亡。

2.2.4 蛇床子素

蛇床子素是从香豆素伞形科植物如蛇床子中分离出来的。研究表明，它能显著改善大鼠的空间辨别和记忆障碍。蛇床子素的这种效果被认为是与抑制脂质过氧化和大鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶的活性相关。另据报道，蛇床子素能改善三氯化铝诱导加速衰老小鼠的记忆障碍，这归因于它的活性包括谷胱甘肽过氧化物酶( GSH- PX )和超氧化物歧化酶( SOD )的活性，从而减轻ROS诱导神经元的损伤。对于蛇床子素以往的研究主要是集中在其在抗高血压，抗心律失常作用，免疫增强和抗感染。在治疗记忆障碍有关疾病的潜力例如AD需要今后进一步的调查[15]。

2.3 三萜皂苷

多数三萜皂苷是由30个碳原子组成的萜类化合物，多数可溶于水，水溶液振摇后产生似肥皂水样泡沫，故称为三萜皂苷。三萜皂苷广泛分布于自然界，菌类、蕨类、单子叶、双子叶植物、动物及海洋生物中均有分布。其中人参皂苷、三七总皂苷对AD有明显的治疗效果。

2.3.1 人参皂苷

在中国人参是常见的药材，被广泛用于提高记忆力，延缓衰老。许多体内和体外研究表明，它在治疗老化、中枢神经系统疾病以及神经变性疾病如AD中起到了很好的作用。经过验证，人参皂苷Rg1(GRg1)及Rb1(GRb1)是人参的主要药理活性成分，其作用机制是：(1)通过调节神经突增生、抑制神经炎症的发生和淀粉样蛋白的积累，能够起到防治AD的作用[15]。(2)GRg1能抑制自由基形成并加快清除大脑中的自由基，同时抑制神经细胞凋亡，保护神经元细胞。(3)GRb1能够增加乙酰胆碱的合成和释放，并抑制神经炎的发生和过氧化，保护海马神经元[16]。

2.3.2 三七皂苷

三七皂苷(PNS)具有广泛的生物活性，包括抗炎，抗纤维化，清除自由基，抗老化等，这些三七皂甙的主要有效成分属于达玛烷型。郭等人报道称[17]，PNS能增加通过注射鹅膏蕈氨酸到核基底核造成的核基底损伤(NBM)的痴呆大鼠的学习记忆能力。PNS能缓解由Aβ25-35造成的神经元损伤，从而减少神经元细胞凋亡。此外，PNS也促进神经细胞的生长，延长了轴突的长度和，突触的可塑性增加。除了这些作用，PNS能阻止胆碱乙酰转移酶的减少，从而增强了AD模型大鼠胆碱能神经元的功能。这些PNS活性可能构成抗AD活性的药理学基础。

2.4 生物碱

生物碱是科学家研究最早的一类有生物活性的重要天然有机化合物。它被定义为含负氧化态氮原子、存在于生物有机体中的非初级代谢产物的一类化合物。研究发现生物碱在抗AD的机制主要集中在提高胆碱能系统的活性，抑制令人兴奋的中枢神经系统。加兰他敏，一种生物碱，作为一种有效治疗AD的药物在全球已被广泛接受。其他生物碱，包括石杉碱甲，苦参碱等在抗AD方面也有很好的疗效。

2.4.1 黄连生物碱

黄连为多年生草本植物，是我国的传统中药，具有清热解毒等功效。黄连生物碱具有抗病毒、抗炎、抗菌、抗肿瘤、降血糖及免疫调节等作用，黄连生物碱中含量最高的为小檗碱，其抗AD的作用机制表现为以下几个方面：(1)研究发现[18]，小檗碱可通过增加大鼠海马CA3区IGF-1和IGF-1R蛋白的表达,减少Aβ蛋白沉积、减轻神经元丢失、改善锥体细胞形态,提高AD模型大鼠的认知功能。(2)小檗碱能抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)，丁酰胆碱酯酶(BChE)，和单胺氧化酶(MAO)的活性。提高胆碱能神经系统的功能[19]。(3)Durairajan 等[20]研究发现黄连素可通过通过降低磷酸化Tau 蛋白的水平，减少了细胞内神经元纤维缠结的形成，对脑内神经细胞起到保护作用，进而预防和治疗AD。

2.4.2 石杉碱甲

石杉碱甲是从蛇足石杉中分离的一种具有抗乙酰胆碱酯酶活性的石松生物碱类有效单体。它也是一个NMDA受体拮抗剂其可减少脑中谷氨酸诱导的损伤[21]。它是高脂溶性的，因而易于穿过血 - 脑屏障，口服后分散到大脑中。动物研究发现，它能够增强大鼠的记忆功能。中国的临床试验表明，它与加兰他敏和多奈哌齐相比同样有效，或许在副作用方面甚至更安全。1994年以来在中国它被批准并广泛用于治疗老年人的记忆障碍，失忆或AD病人。近年来在美国和欧洲国家，石杉碱甲在治疗AD效果上已经吸引了越来越多的关注。目前，在美国石杉碱甲被用作膳食补充剂来提高记忆[22]。

2.4.3 苦参碱

苦参碱是豆科植物苦参的主要有效成分,研究发现苦参碱能降低大脑皮层和海马区白细胞介素1β的表达水平。因此，在抗AD中，苦参碱的作用可能归因于它通过抑制炎性细胞因子在大脑中释放来缓解炎症，从而改善受损神经元细胞的状态并减少神经元凋亡。

3 其他类

3.1 藏红花

藏红花(也称西红花)为番红花属植物, 属莺尾科, 藏红花的药用部位是藏红花的柱头，也是最昂贵的香料之一。研究发现藏红花中藏红花素是有效的抗氧化剂。它能清除自由基，特别是超氧阴离子，因此，可保护细胞免受氧化应激。防止各种中枢神经系统的神经性病变，如阿尔茨海默氏病。因此，经研究验证藏红花对阿尔茨海默病有很好的治疗效果[23]。

3.2 雷公藤甲素

雷公藤甲素，是从卫矛科植物雷公藤中分离出来的二萜类化合物，具有多种药理特性，包括抗炎、抗氧化和免疫抑制等活性。研究表明，雷公藤甲素对神经元有明显的保护作用。我们以往的研究发现，雷公藤甲素能促进AD细胞模型海马神经元突触素的表达，从而对海马神经元起到保护作用。此外，TP可以抑制海马内Aβ的沉积与纤维化形成老年斑，并且抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化与增殖，以及抑制COX-2的表达，说明雷公藤甲素对AD 大鼠脑内慢性炎症反应具有一定的抑制作用[24]。

4 展望

AD的发病机制非常复杂，迄今为止没有一种学说能够完全解释AD的发病机制。因此发现和开发预防、治疗AD的药物显得尤为重要。最近几十年来，随着科学技术的进步，一些活性成分已经从这些草药中分离出来，对于治疗AD的效果，无论在体外还是体内都进行了活性研究。一方面，这些成果为临床医学上使用这些药物来治疗AD提供了基本依据，另一方面，发现了许多单体化合物作为有前途的药物或主要化合物，为治疗AD来开发新药。

目前治疗AD的药物主要是症状治疗的药物，他们能改善症状，如记忆障碍等。在治疗AD中发挥了关键作用，但这些药物不能逆转AD，只能延缓进展，它们可能不像单一目标的药物能达到满意的疗效。黄酮类和苯丙素类中的一些制剂表现出多种生物活性，可能代表新药未来的发展方向。

在研究和开发天然抗AD的药物中也存在许多问题。重复和对比实验结果差异有时是因为它对于同一植物分离方法和提纯方法不同、有效成分含量的研究不同。此外，由于在某些情况下缺乏阳性对照药物，有效性很难被准确评估。研究天然产物在预防和治疗AD的起步较晚，目前主要是一直保持在体外和动物实验研究的平台。从长远来看，研究应集中在筛选和选择最佳的原料药、建立对药物有效性的评估标准等。

[1]Touqeer Ahmed,Anwarul-Hassan Gilani.Therapeutic Potential of Turmeric in Alzheimer’s Disease Curcumin or Curcuminoilds[J].2014,28(2):517-525

[2]应侠，吴振，雷严，等. 阿尔茨海默病的发病机制及治疗药物研究进展[J].中国药房，2015,25(33)：3152-3155

[3]陈乔，侯吉华，谢斌，等.基于“胆碱能假说”中药抗老年痴呆研究进展[J].江西中医学院学报,2010,22(5):95-97

[4]闫蓉，常翔，杨从，等.阿尔兹海默病β淀粉样蛋白形成和沉积的发病机制及中医药干预的可能途径[J].中药新药与临床药理,2013,24(6):629-632

[5]李艳霞，曹梦媛，李艳萌. 阿尔茨海默病中Tau 蛋白与相关分子作用的探究[J].医学研究与教育，2014,31(3)：72-75

[6]Xiao-Tian Huang,Zhong-Ming Qian,XuanHe,et al.Reducing iron in the brain:a novel pharmacologic mechanism of huperzine A in the treatment of Alzheimer’s disease[J].Neurobiology of Aging,2013,1-10

[7]梅峥嵘，谭湘萍，黄汉辉，等.葛根素对阿尔茨海默病细胞模型Aβ蛋白的抑制作用[J].中国现代应用药学,2015,32(1):5-9

[8]Zhi-Li Ren,Ping-Ping Zuo.Neural Regeneration:Role of Traditional Chinese Medicine in Neurological Diseases Treatment[J].Journal of Pharmacological Sciences,2012,120:139-145

[9]Jian Jun Gao,Yoshinori Inagaki,Yang Liu.Research Progress on fiavonoids is dated from traditional chinese medicine in treatment of Alzheimer’s disease[J].Intractable & RareDiseases Research,2013,2(1):3-10

[10]蔡标，汪远金，王艳，等.大豆异黄酮对阿尔茨海默病大鼠乙酰胆碱代谢的影响[J]. 安徽中医学院学报，2013,32(1)：89

[11]Eun-Ju Yang,Gyu Hwan Park,Kyung-Sik Song.Neuroprotective effects of liquiritigenin isolated from licorice roots on glutamate-induced apoptosis in hippocampal neuronal cells[J].NeuroToxicology,2013,39:114-123

[12]Kwok Kin Cheng,Chin Fung Yeung,ShukWaiHo.Highly Stabilized Curcumin Nanoparticles Tested in an In Vitro Blood-Brain Barrier Model and in Alzheimer’s Disease Tg2576 Mice [J].The APPS Journal,2012,(12):9444-9447

[13]Ji-Jing Yan,Jun-sub Jung,Taek-keun Kim.Protective Effects of Ferulic Acid in Amyloid Precursor Protein Plus Presenilin-1 Transgenic Mouse Model Of Alzheimer Disease[J].Biol Pharm Bul,2013,36(1):140-143

[14]Jian Jun Gao,Yoshinori Inagaki,Yang Liu.Research Progress on fiavonoids is dated from traditional chinese medicine in treatment of Alzheimer’s disease[J].Intractable & RareDiseases Research，2013，2(1):3-10

[15]XIAN-Hui dong,WEI-Juan gao,WEI-Na kong,et al.Neuroprotective effects of the active components of three chinese herbs on brain iron load in a mouse model of Alzheimer’s disease[J].Experimentac and therarpeutic medicine,2015,9:1319-1327

[16]NaijingLi,LingZhou,WeiLi.Protective effects of ginsenosides Rg1 and Rb1 on an Alzheimer’s disease mouse model:A metabolonics study [J].Journal of ChromatographyB,2015,985:54-61

[17]Jian Jun Gao,Yoshinori Inagaki,Yang Liu.Research Progress on fiavonoids is dated from traditional chinese medicine in treatment of Alzheimer’s disease[J].Intractable & RareDiseases Research,2013,2(1):3-10

[18]左茹，曹雪滨，张文生.黄连素治疗阿尔茨海默病的研究进展[J].中草药,2014,45(8):1184-1187

[19]Jian Jun Gao,Yoshinori Inagaki,Yang Liu.Research Progress on fiavonoids is dated from traditional chinese medicine in treatment of Alzheimer’s disease[J].Intractable & RareDiseases Research,2013,2(1):3-10

[20]Hong-Fang ji,Liang shen.Molecular Basis of Inhibitory Activitiies of Berberine against Pathogenic Enzymes in Alzheimer’s Disease[J].The Scientific World Journal,2012,82:517-525

[21]Durairajan S S, Liu L F, Lu J H, et al. Berberine ameliorates beta-amyloid pathology, gliosis, and cognitive impairment in an Alzheimer's disease transgenicmouse model [J]. Neurobiol Aging,2012, 33(12):1169

[22]Ynag Su,Qiu hong Wang,chang fu Wang,et al.The treatment of Alzheimer’s disease using Chinese Medicinal Plants:Fromdisease models to potential clinical applications[J].Journal of Ethnopharmacology,2014,152:403-423

[23]许明，宋新波，张丽娟. 石杉碱甲的研究进展[J].Drug Evaluation Research,2010,33(6):442-446

[24]Bin Wan,Xiaoling Hu,Jing Nie,et al.Effects of triptolide on degeneration of dendritic spines induced by Aβ1-40 injection in rat hippocampus[J].Neurol,2014,35:35-40

黑龙江省教育厅面上项目，编号：12511574。

胡艳秋(1983～)女，黑龙江双鸭山人，硕士，讲师。

苏瑾(1976～)女，黑龙江佳木斯人，博士，副教授，硕士研究生导师。E-mail: sj0129@163.com。

R749.1+6

A

1008-0104(2016)06-0012-04

2016-05-14)