微RNA调控间充质干细胞软骨分化的机制研究进展

杨坤　解磊　朱伟民　黄江鸿　段莉　王大平

·综述·

微RNA调控间充质干细胞软骨分化的机制研究进展

杨坤解磊朱伟民黄江鸿段莉王大平

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是软骨组织工程的一种理想种子细胞，体外条件下诱导MSCs软骨分化，将直接影响组织工程修复软骨的成败。微RNA（microRNA，miRNA）是一类由内源基因编码、长度为22个核苷酸左右的单链RNA，在细胞增殖、分化、凋亡以及疾病发生过程中发挥重要的调控功能，其在转录后水平调控与软骨分化相关转录因子及信号通路靶基因的表达，以此调控MSCs软骨分化。本文就miRNA调控MSCs软骨分化的机制研究进展作一综述。

微RNA；间充质干细胞；软骨分化；调控机制

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是一类来源于中胚层的成体干细胞，其来源十分广泛，可以从骨髓、脐血、脂肪等组织中分离得到。MSCs具有自我增殖、更新的能力，并且可以被诱导向多种组织细胞分化，包括成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、心肌细胞及脂肪细胞［1］。MSCs不仅易于体外大量扩增，还是良好的外来基因导入宿主，在软骨损伤疾病治疗领域具有广阔的应用前景。MSCs软骨分化主要经历间充质细胞（前体软骨细胞）、压缩间充质细胞、软骨细胞、增殖型软骨细胞、前体肥大化软骨细胞及肥大化软骨细胞这6个阶段［2］，涉及多种转录因子、细胞生长因子和相关信号通路共同相互调控完成。

微RNA（microRNA，miRNA）是由内源基因编码的短链非编码RNA［3］，以多种形式存在于基因组的基因间隔区［4］，通过与靶mRNA的非转录区特异性结合促进靶mRNA的降解和（或）抑制蛋白翻译，从而抑制靶基因的表达［5］，以此影响细胞的增殖、分裂、分化、代谢以及凋亡等生物过程。有研究报道，多种miRNA通过调控转录因子及生长因子转录后水平来调控软骨分化过程［6］。

一、软骨分化相关调控因子

Sox（Sry⁃related high mobility groupbox）是一类与Y染色体上性别决定基因Sry同源、具有特征性HMG⁃box序列的基因家族。由于Sox编码的产物可以与DNA上的特异性序列结合，因此Sox家族被认为在基因转录调控中发挥重要作用。Sox9作为一种转录因子，被认为是软骨细胞表型的“主调控因子”，在软骨分化中发挥重要作用［7］。Sox9在压缩间充质细胞及软骨细胞中表达水平较高，调控Ⅱ型胶原、Ⅺ型胶原及蛋白聚糖的表达，对软骨形成发挥重要作用［8］，其同源家族中的转录因子Sox5和Sox6能提高Sox9的活性，对软骨形成也是必需的［9］。

转化生长因子β（transforming growth factor⁃β，TGF⁃β）是一类拥有众多生物活性的多肽类生长因子，人体内存在4种亚型。TGF⁃β具有多重生物学效应，是调节MSCs增殖并向软骨细胞方向分化的最主要因子之一［10］。

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一类在骨和软骨形成及稳定中发挥重要作用的生长因子，至今发现的BMP有17种，绝大部分属于TGF⁃β超家族成员。段晓辉等［11］研究发现成骨细胞及破骨细胞可通过分泌BMP来诱导骨与软骨的形成。BMP与Ⅰ、Ⅱ型BMP受体结合而激活Smad及促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路［12］。BMP⁃2和BMP⁃4是诱导软骨细胞分化的重要生长因子。

纤维母细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGF）是一种具有促进细胞有丝分裂、增殖与分化等多种生物活性的多聚肽。FGF通过结合细胞表面酪氨酸激酶受体和（或）纤维母细胞生长因子受体，激活包括MAPK及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）在内的多种信号通路，从而对软骨细胞分化进行调控［13］。

二、负向调控MSCs成软骨分化的miRNA

转录因子Slug被认为是MSCs成软骨分化的一种负向调控因子［14］。Lolli等［15］对人脐带血来源MSCs分别进行了an⁃tagomiR⁃221转染和siRNA沉默Slug的实验，发现低水平的Slug和miR⁃221可以增加Ⅱ型胶原、转录因子Sox9及TRPS1的表达，进一步研究结果表明miR⁃221受到Slug的调节，这一研究提示可以通过下调MSCs软骨分化负向调控的miR⁃NA，在转录后水平来促进干细胞成软骨分化。Kim等［16］对鸡的肢体MSCs成软骨分化研究同样表明miR⁃221负向调控MSCs成软骨分化。然而，以上研究均并未发现miR⁃221的直接靶基因，也未能明确miR⁃221调控软骨分化的具体机制。

Guérit等［17］的研究显示在MSCs软骨分化早期，miR⁃29a下调靶基因Foxo3A（一种转录因子）的表达，抑制MSCs软骨分化。Djouad等［18］却发现上调Foxo3A在软骨分化中起到抑制软骨分化作用。Yan等［19］研究鼠MSCs软骨细胞分化时，发现miR⁃29a和miR⁃29b通过下调靶基因Col2a1表达，抑制MSCs软骨分化。Foxo3A和Col2a1均为miR⁃29a的靶基因，一种miRNA可拥有多个靶基因，表明其调控网络的复杂性。

Lee等［20］研究证实miR⁃495在Sox9的3′⁃UTR存在一个结合位点，miR⁃495直接通过下调Sox9的表达来抑制人MSCs的软骨分化。Yang等［21］在研究鼠胚胎MSCs（C3H10T1/2细胞系）软骨分化过程中发现miR⁃145下调靶基因Sox9表达，最终导致软骨细胞标志基因Col2a1、Acan（蛋白聚糖）、Col9a2、Col11a1的mRNA水平降低。在人骨髓MSCs（hM⁃SCs）成软骨分化和人的软骨肉瘤细胞中miR⁃449a通过下调靶基因Lef1（Wnt信号通路重要组成部分）表达，使得Ⅱ型胶原和Sox9表达下调以及蛋白多糖的生成减少［22］。miR⁃199a抑制软骨形成早期标志物表达，如软骨寡聚基质蛋白（COMP）、Ⅱ型胶原及Sox9［23］。Sox9作为miR⁃495和miR⁃145的靶基因，在MSCs成软骨分化Wnt/β⁃catenin和TGF⁃β/Smad信号转导通路中起到重要作用。利用基因工程技术向MSCs转染Sox9基因，通过上调Sox9表达来提高MSCs成软骨分化潜能，这种在基因组水平调控干细胞软骨分化的技术已经成为目前及未来研究的热点。Song等［24］利用TGF⁃β3对鸡的肢体MSCs进行诱导软骨分化，发现骨关节炎上调表达的miR⁃181b出现表达下调。进一步的研究表明miR⁃181b是软骨发育的负调控因子，抑制miR⁃181b的表达或许可以用于治疗软骨相关疾病。Hou等［25］对脂肪来源的干细胞诱导成软骨分化，揭示miR⁃193b通过靶定TGF⁃β2和TGFBR3（TGF⁃β re⁃ceptor 3）来负向调控TGF⁃β信号通路，最终抑制干细胞早期的软骨分化。

三、正向调控MSCs成软骨分化的miRNA

Lin等［26］在研究鼠的MSCs软骨分化中发现miR⁃335⁃5p和它的宿主基因Mest共表达，miR⁃335⁃5p过表达促进MSCs软骨细胞分化。miR⁃335⁃5p靶向Daam1和ROCK1，后两者均为Sox9的负调节因子。Sox9下调miR⁃29a和miR⁃29b的表达，后两者为Mest负调节因子。因此从miR⁃335⁃5p→Sox9→Mest/miR⁃335⁃5p形成了一个正反馈，循环促进软骨分化。然而，研究人员并未对此循环通路的作用及调控机制进行更加深入的研究，并且研究对象局限于鼠的MSCs。Karlsen等［27］的体外BMSCs软骨分化实验表明miR⁃140通过上调Sox9和Acan表达水平，促进hMSCs软骨分化。RALA（v⁃ral白血病致病因子）被确认是miR⁃140的一个靶基因，软骨分化过程中被抑制的RALA导致Sox9表达上调。研究人员发现RALA抑制Sox9蛋白翻译，而不影响Sox9的mRNA转录，RALA与Sox9作用关系仍不清楚。Barter等［28］通过研究hMSCs成软骨分化证明miR⁃140⁃5p是调控软骨生成主要的miRNA，且miR ⁃140⁃5p调控与骨骼系统发育密切相关的Wnt信号通路。Ham等［29］研究得出H⁃89（PKA抑制剂）和miR⁃23b通过下调PKA信号通路来诱导MSCs向软骨细胞分化，并认为在MSCs软骨分化过程中H⁃89诱导miR⁃23b表达。Ham等［30］从上述研究结果得到启发后，对转染H⁃89和（或）miR⁃23b关节液来源的MSCs进行诱导软骨分化，显示转染组软骨分化增加，通过上调miR⁃23b表达来抑制PKA信号通路可以提高自体软骨治疗的潜能。老化的MSCs分化潜能降低，Li等［31］发现表达上调的miR⁃10a通过靶向Kruppel样因子4（Kruppel⁃like factor 4，KLF4）增加老化的MSCs成脂肪、成骨及成软骨分化能力。

四、其他差异性表达的miRNA

Han等［32］对骨髓来源MSCs体外诱导软骨分化过程中的miRNA表达差异进行分析，筛选出4种（miR⁃130b、miR⁃152、miR⁃28、miR⁃26b）差异性表达的miRNA，但未对差异性表达的miRNA逐一进行功能、靶基因及干细胞成软骨分化调控的研究。Zhang等［33］对脂肪来源的MSCs体外诱导软骨分化前后的miRNA表达谱进行对比，显示12种miRNA在诱导分化前后存在明显差异性表达，其中包括8种上调表达的miRNA：miR⁃193b、miR⁃199a⁃3p、miR⁃455⁃3p、miR⁃210、miR⁃381、miR⁃92a、miR⁃320c及miR⁃136，及4种下调表达的miRNA：miR⁃490⁃5p、miR⁃4287、miR⁃BART8和miR⁃US25⁃1。随后研究人员对差异性表达的miRNA进行了靶基因预测，这些靶基因可能参与干细胞成软骨分化、增殖、凋亡，以及介导细胞内相关信号通路。Yang等［34］对脂肪来源的干细胞进行相似的研究，发现干细胞成软骨分化中12种上调表达的miRNA：miR⁃196a、miR⁃143、miR⁃383、miR⁃193b、let⁃7i、miR⁃26a、miR⁃539、miR⁃199a⁃3p、miR⁃337⁃5p、miR⁃146a⁃5p、miR⁃646及miR⁃381，8种下调表达的miRNA：miR⁃490⁃5p、miR⁃1307、miR⁃125b、miR⁃96⁃3p、miR⁃302⁃3p、miR⁃23a⁃3p、miR⁃590及miR⁃510，其中部分差异性表达的miRNA与Zhang的研究是相吻合的。随后研究者对差异表达显著的miR⁃196a和miR⁃490⁃5p进行研究，发现上调miR⁃490⁃5p的表达可以提高Col2a1、Col10a1及蛋白聚糖表达，骨形态蛋白受体2（bone morphogenetic protein receptor type 2，BMPR2）为miR⁃490⁃5p直接靶基因。Buechli等［35］揭示了miR⁃140在正常马的软骨及马脐血来源MSCs软骨分化14 d后的高表达。miR⁃140是一个软骨发育和稳定的重要调节因子，CXCL12（趋化因子配体-12）和ADAMTS⁃5（蛋白聚糖酶-2）是miR⁃140靶基因。Laine等［36］在对骨髓来源的MSCs诱导分化成软骨中区别性地表达的miRNA分析后，发现miR⁃96在成软骨中表达不增加，而miR⁃199a在成软骨中被上调。Yang等［37］对鼠的MSCs软骨分化四个不同阶段实施miRNA微阵列，发现2个miRNA簇，miR⁃143/145和miR⁃132/212，在MSCs软骨分化中持续下调。

MSCs软骨分化是一个较为复杂的生物过程，这其中涉及众多转录因子、细胞因子及信号通路相互作用共同完成。miRNA在转录后水平调控软骨分化过程中相关的转录因子及信号通路分子，以此调控干细胞软骨分化。但往往一个miRNA有多个潜在靶基因，而一个潜在靶基因又受到多个miRNA调控，这表明miRNA在干细胞软骨分化过程中存在着复杂的调控网络。对miRNA在MSCs软骨分化过程的调控机制的研究，不仅有助于阐明干细胞分化分子机制，而且可以通过操纵相关miRNA来提高MSCs成软骨分化潜能，最终为软骨修复带来新的希望。

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10.3969/j.issn.1674⁃8573.2016.03.018

国家自然科学基金（81572198），广东省自然科学基金（2015A030313772）

518000广东深圳，安徽医科大学深圳市第二人民医院临床学院（杨坤、王大平）；深圳市第二人民医院组织工程重点实验室（杨坤、解磊、朱伟民、黄江鸿、段莉、王大平）

王大平，E⁃mail：dapingwang1963@qq.com

2015⁃09⁃14）