非编码RNA作为原发性肝癌分子标志物的研究进展

杨森，袁声贤，周伟平，薛焕洲



·文献综述·

非编码RNA作为原发性肝癌分子标志物的研究进展

杨森1，袁声贤2，周伟平2，薛焕洲1

（1.郑州大学人民医院/河南省人民医院 肝胆胰外科，河南 郑州 450003；2.东方肝胆外科医院 肝外三科，上海 200438）

原发性肝癌是严重威胁生命健康的恶性肿瘤，病死率居高不下。进一步提高其早期诊断率，可使其病死率大大降低；另外，根据肿瘤的生物学特性，进行个体化的治疗，也将有助于改善目前的治疗状况。这些都依赖于原发性肝癌早期诊断、分型和预后判断等技术的提高。目前传统的诊断标志物诊断效果还不理想，现有的分子分型和预后判断体系离临床应用也尚远。近十年来，包括microRNA和lncRNA在内的非编码RNA研究的迅速进展，给原发性肝癌的诊断、分型和预后判断提供了新思路，显示了较高的应用价值。本文就非编码RNA在原发性肝癌诊断、分型和预后判断方面的应用作一综述。

肝肿瘤；非编码RNA；诊断；分型；预后

肝癌是我国发病率和死亡率均较高并带来沉重经济社会负担的一种恶性肿瘤，其治疗效果仍不理想。因发现较晚而不能得到根治性切除是目前疗效差的重要原因。东方肝胆外科医院一项大宗病例的回顾性分析显示，该院5 524例肝癌患者中肿瘤直径小于3 cm的仅占13％［1］。因此早诊早治疗是提高肝癌疗效、降低病死率极为重要的措施。而目前用于肝癌诊断的传统标志物还不理想，尤其是早期诊断效果差，因而亟待开发方便、廉价、高效的新的标记分子，以提高肝癌的早期诊断水平。另外，利用分子分型的方法将肝癌分为生物特性不同的亚型，通过肝癌的分子标记评判肝癌的预后，将有利于开发肝癌的分子靶向药物，有利于指导肝癌的个体化治疗，进而提高肝癌的疗效。既往用于肝癌分子分型或评判预后的标志物多集中在蛋白质，尚未发现能够用于指导肝癌特定治疗的分子亚型。近些年来，非编码RNA在生命医学领域受到越来越多的关注，并取得重大进展，让人们对生命现象有了新的认知，对疾病的诊断与治疗有了新的思路。本文就其在肝癌诊断、分型及预后判断方面的应用作一综述。

1 非编码RNA简介

现代生物学一个很让人不解的现象是，用于编码蛋白的约20 000个基因在人类基因组所占的比例还不足2％［2］。高通量芯片和测序技术的发展使得了解整个人类的转录组成为可能，人们发现，人类转录组的复杂性远远超过了蛋白编码基因转录产物的集合，广阔的人类基因组“黑暗地带”均可转录，产生了大量的非编码RNA［3-4］。

非编码RNA有很多不同的类型，根据其序列的大小分为小非编码RNA和长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。小的非编码RNA包括的类型有microRNA、piRNA和snoRNA等。其中microRNA在目前非编码RNA中研究的最清楚，它是一种内源性单链小分子RNA，长度约22个核苷酸，可进行基因转录后水平的调节［5］。大量的研究表明microRNA是一类十分重要的调控分子，它们的异常表达与包括肿瘤在内的众多疾病密切相关。长链非编码RNA目前还没有统一的定义一般认为它们是一类长度大于200 nt且没有明显开放阅读框的非编码RNA。最早报道的lncRNA-H19，其发现要早于microRNA［6］，但microRNA lin-14的发现使人们将目光迅速转向microRNA。直到FANTOM和ENCODE等大规模转录组测序的开展，人们发现哺乳动物基因组存在大范围转录活动，又加上一些新发现的lncRNA功能机制的阐明，lncRNA迅速成为近5年来生命医学领域的研究热点。对于数量庞大的lncRNA，学术界对其功能性还存在争议［7］。可以肯定的是，lncRNA在生物体内存在时空特异性表达，在包括肿瘤在内的多种疾病中其表达谱发生了明显的改变，已经发现了许多在疾病发生发展中起重要作用的lncRNA［8-10］。不同于microRNA相对单一的作用方式，lncRNA的作用机制十分复杂，目前发现的lncRNA可以从表观遗传、转录、转录后等多个水平发挥调控作用［11］。

2 非编码RNA在肝癌中的诊断作用

提高肝癌的早期诊断率，无疑将会大大降低目前肝癌病死率。做到这一点，一是需要加强对高危人群的筛查，二是要提高目前的肝癌诊断技术，尤其是早期诊断技术。目前肝癌的诊断主要依赖影像学和血清标志物。各种影像学诊断方法各有优劣，但早期诊断效果不好。甲胎蛋白（AFP）是目前国内外应用最广的用于肝癌诊断的血清标志物，但其敏感性和特异性仍不理想，特别是早期肝癌只有10％～20％的患者表现出血清甲胎蛋白异常［12-13］。因此，2011年欧洲肝病协会在制定新的肝癌诊断指南时，甚至都没采用甲胎蛋白这一指标［14］。近些年来陆续发现了一些新的分子标志物，如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC-3）、异常凝血酶原（DCP）、高尔基蛋白-73（GP-73），这些标志物单独或联合使用，在一定程度上提高了肝癌的诊断效果。这些分子标志物均是蛋白质，而近些年非编码RNA研究的迅速进展，为寻找新型肝癌诊断标志物提供了新线索。

大量的研究显示，人体血液中稳定存在大量的microRNA，且在肝癌中其表达谱发生了明显的改变［15-16］，提示microRNA有可能作为新型的分子标志物用于肝癌的诊断。国内外学者在这方面做了大量探索。Yamamoto等［17］最早报道了microRNA在肝癌患者血清中的改变。他们发现miR-500在肝癌患者术前的血清中升高，术后恢复正常，提示其是肝癌诊断中一个潜在的标志物。Qu等［16］回顾性的在105例肝癌患者、107例慢性肝病患者以及71例正常人的血清中检测了miR-16、miR-195、miR-199a的表达，结果显示单个标志物对肝癌的诊断敏感性大小依次为miR-16、miR-199a、AFP、DCP、AFP-L3％、miR-195，联合使用miR-16、AFP、DCP、AFP-L3％产生最好的诊断效果，敏感性为92.4％，特异性为78.5％。miR-16可以显著改善3个传统标志物的诊断敏感性和特异性。Zhou等［18］利用含量为723的microRNA芯片在包含正常人、慢性乙肝患者、肝硬化患者和肝癌患者的137例患者的血清中筛查，然后在407例患者的队列建立模型，接着在另一个包含390例患者的队列验证，最终确定了一个用于肝癌诊断的microRNA组（miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a、miR-801），它在建模队列和验证队列的AUC值分别可以达到0.864和0.888，而且其诊断的准确性不受肝癌巴塞罗那分期的影响，对0期的AUC值可达0.888。另外该模型可以很好的将肝癌患者与正常人、慢性乙型肝炎患者和肝硬化患者区分开，该研究成果有潜在的临床应用价值。以上研究说明microRNA是很有前景的肝癌诊断标志物。

和microRNA一样，lncRNA表达谱在众多肿瘤中也表现出显著的改变，因而也有潜在诊断价值。例如，lncRNA PCA/ DD3被发现在前列腺癌特异性的高表达，并且在尿中可以检测到，联合传统的PSA检查以及其它的临床信息可以提高前列腺癌的诊断准确性［19］。另外，Panzitt等［20］发现了一条在肝癌中特异性升高的lncRNA HULC，并且发现该lncRNA可以在人体血液中检测到，是一个肝癌潜在的诊断标志物。Xie等［21］研究发现HULC可在63％的肝癌患者中检测到，但并未提及其在肝癌诊断中的特异性和敏感性。另外，Tang等［22］研究发现联合使用RP11-160H22.5、XLOC-014172及LOC149086诊断肝癌，AUC值可达0.896，敏感性和特异性分别可达82％和73％。Lu等［23］的研究鉴定了另外1条lncRNA-AF085935作为肝癌诊断的潜在标志物，其不仅可以区分健康人和肝癌患者还可以区分慢性乙肝患者和肝癌患者，其AUC值分别可达0.96和0.86。相比microRNA，目前lncRNA在肝癌诊断方面的研究还比较少，其诊断价值还需进一步研究。

3 非编码RNA在肝癌分型和预后判断方面的应用

当前临床工作中，主要利用肝癌患者的一些临床病理指标如肿瘤大小、肿瘤数目、有无血管侵犯和子灶等，来给肝癌分期分型，用于评判转移、复发和生存等预后信息，进而指导患者治疗方案的选择［24］。但随着肝癌早期诊断率的提高，这些临床病理指标，在评判预后和分型方面显得不足。大量的研究显示，肝癌存在高度的异质性，不同的肝癌在发生发展过程中伴随着不同信号通路的改变［25］。因而利用不同的分子标志物将肝癌分为生物学性质不同的亚型，将有助于评判肝癌的预后，有助于开发分子靶向性药物，进而采取靶向性、个体化治疗，这是未来肝癌治疗的发展方向。为此，国内外学者做了很多努力，根据肝癌的基因组、转录组的不同，提出了多个肝癌的分子亚型，如Wnt亚型、增殖亚型、炎症亚型［13，26-27］。

microRNA在肝癌分子分型和预后判断方面显示出良好的前景。Budhu等［28］在241个肝癌患者的癌与癌旁中检测microRNA的表达谱，在另外131例肝癌患者的队列中建立了一个包含20个microRNA的肝癌转移标签，可以很好的预测肝癌患者术后复发转移风险。Ji等［29］在241个肝癌患者的队列中来寻找肝癌相关的 microRNA，并在另外一个独立的队列验证，检测其与患者生存和干扰素反应性的相关性。他们发现miR-26表达水平不同的肿瘤表现出完全不同的转录组类型，肿瘤miR-26表达低的患者具有生存率较差，但对干扰素反应性较好。该研究是一个前瞻性的随机对照研究，具有较高的说服力。Toffanin等［30］在89例肝癌样本中检测microRNA表达谱，将肝癌分为3个亚型：无翅型MMTV整合位点型（36％）、干扰素相关型（33％）和增殖型（31％）。除此之外，还有大量的microRNA被发现与肝癌的预后相关。

lncRNA虽是一个新兴的研究领域，但已有大量的研究显示其与肝癌患者的预后明显相关。Ishibashi等［31］报道肝癌中表达HOTAIR的患者比不表达HOTAIR的患者预后要差。Lai等［32］报道肝癌中lncRNA MALAT1的高表达提示着患者肝移植术后的高复发风险。Zhang等［33］报道lncRNA SNHG15是肝癌的一个潜在预后因子。第二军医大学医学遗传实验室是国内最早开展lncRNA研究的单位之一，Yang等［34］做了第一个肝癌的lncRNA表达谱芯片，发现肝癌的lncRNA表达谱相比癌旁组织发生了明显改变，从这些表达差异的lncRNA中找到了数个跟肝癌预后密切相关的lncRNA。他们报道了一条新的lncRNA（命名为HEIH），发现它在肝癌中表达显著上调，并且其表达量与肝癌的总体生存率相关。东方肝胆外科医院的Yuan等［35］也从该芯片找到一条新的lncRNA（命名为MVIH），在215个肝癌样本中检测了它的表达，发现它是肝癌复发的独立的危险因素。该实验室的Yuan等［36］则发现了一条受TGF-β调控的lncRNAATB，其在肝癌的转移灶中升高，促进肝癌的侵袭转移，与肝癌患者的预后密切相关。总的来讲，lncRNA在肝癌分型预后方面的研究还比较少，也缺乏大样本、前瞻性的随机对照研究，但其在这方面的潜质，已受到越来越多的关注。

4 问题与展望

肝癌的发生发展过程往往涉及多条信号通路的改变，单一的分子在肝癌诊断、分型和预后判断的作用有限，在将来，将DNA、蛋白质和非编码RNA等众多分子进行适当的组合，可能会提高肝癌诊断、分型和预后判断的准确性［37］。另外当前的研究比较分散，各研究小组在选用样本数量、疾病背景、地域分布等方面差别较大，研究结果重叠较小，因而将各小组的结果进行整合分析，进行多中心、大样本的前瞻性随机对照研究，将有助于加快从实验室到临床的步伐，尽早造福广大患者。

诊断用肿瘤标志物不仅用于肿瘤的早期诊断及定性，对于肿瘤复发转移的早期诊断同样意义重大。一般而言，某标志物如果能用于肿瘤的早期诊断及定性，也能用于肿瘤的复发的监测，如AFP、CA19-9等，故推测如某非编码RNA能够用于肝癌的早期诊断，应该也能用于肝癌复发转移的早期诊断。而目前的研究主要集中在非编码RNA在肝癌早期诊断的作用上，少有文献报道其直接用于肝癌复发转移的诊断上（仅有少量文献报道某lncRNA可以区分肿瘤是否伴随远处转移［38］），该方面仍需进一步的研究。

目前的研究显示，lncRNA可以在血液、尿液、唾液等人体体液中稳定存在［39-40］，而且多以脂质体（exosome）内容物的形式存在［41］，可以通过PCR、分子杂交、测序等常规技术进行检测。但是，它们在体液中的绝对含量往往较低，而且标本收集储存方法的不当常引起其检测的准确性。进一步技术的改进，将有助于其在临床中的应用。

后基因组时代的到来，人们意识到生命活动远比想象的要复杂，远远不是几个公式，几条通路就能将其描述清楚的。近些年来逐渐兴起的非编码RNA研究，使科学家们意识到生命活动是由一个由蛋白质和非编码RNA等组成的极为复杂的网络所调控的。对于数量庞大的非编码RNA，尤其是lncRNA，人们目前所知道的只是冰山一角，有巨大的研究空间。

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（本文编辑：张和）

R604

A DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.05.022

2016-06-01

国家科技重大专项项目（2012ZX10002010）。

杨森（1986-），男，河南民权人，主治医师，硕士。

简介］薛焕洲，主任医师，博士生导师，E-mail：xhzzzu@163.com。