植物组织培养的污染防治

2016-03-08李婷

花卉 2016年18期

关键词：外因杀菌无菌

李婷

（贵州省龙里林场贵州龙里 551200）

植物组织培养的污染防治

李婷

（贵州省龙里林场贵州龙里 551200）

在进行相关的研究中经常会需要对于特定的植物进行培养，以便于获得所需要的信息。但是在进行植物组织培养的过程中，经常会发生培养组织发生污染的现象，导致植物组织的培养失败，无法打到培养的目的。本文首先介绍了植物组织培养过程中发生污染的主要原因以及不同污染的不同特性，然后在此基础上分别介绍了不同污染下应当采取的应对措施，然后阐述了对于植物组织培养中污染苗的抢救方法，以期提高植物组织培养的培养效率。

植物；组织培养；污染防治

1 植物组织培养污染的原因及其特性

1.1 内因污染

内因污染简单的说就是污染的来源是在于培养的内部，也就是说导致污染的污染源在于培养皿内部，也就是来源于培养的植物本身。很多的植物自身的表皮以及内部均含有大量的病菌，这些病菌在植物正常生长过程中不会对植物的生长造成影响，但是在进行植物的组织培养时这些病菌就会进入培养皿中，从而对于植物组织的培养造成影响。这些病菌的种类很多，包括了芽孢杆菌属、、欧文氏菌属、土壤杆菌属、黄单胞菌属、棒状杆菌属霉菌属以及假单胞菌属等。

在进行植物组织培养的初代培养过程中，有时候由于植物表面存在一定的细菌，因此培养时会发现在植物组织的周边会能够观察到不同颜色的菌落以及油污或者水污等。在进行植物组织培养的过程中，如果发现植物的表面在培养初期不存在菌落，但是培养4d左右以后开始不断的出现军力，这就说明时由植物内生的细菌引起的污染。

1.2 外因污染

外因污染指的是由与外在的因素导致的植物组织培养污染，在进行植物组织培养的过程中，如果培养皿或者接种的工具设备等在进行消毒时没有能够确保消毒干净，就会在设备上残留一定的细菌，在进行植物组织培养时这些细菌就会导致植物组织的污染。这一类的外因污染菌种主要以酵母菌、霉菌以及细菌为主。

在进行植物组织培养的过程中，如果发现培养的组织附近出现泡沫或者时粘液，这种情况一般是由于细菌的污染所导致的，说明在进行培养的无菌操作时操作人员存在不规范的操作，导致了细菌的污染。而在培养过程中如果发现培养基中出现不同颜色的霉菌，一般是因为接种时室内的空气被污染而导致的。

2 植物组织培养污染的防治措施

在分析植物组织培养污染的原因时发现植物组织培养过程中污染的主要原因有两个：①内部原因；②外部原因。在植物组织培养的过程中，要想有效的控制污染的发生应当从这两个原因分别入手，有针对性的采取措施来提高培养的成功率。具体的植物组织培养污染防治措施如下：

2.1 内因污染的防治措施

2.1.1 在合适的时间段选取植物

在进行植物组织的培养之前首先要做的便是选择合适的植物来进行取样，在选择植物的时候应当选择植物成熟、等待采摘的时节下的植物，选取的植物部位应当尽量选取采摘的部位。之所以这样选择是因为成熟的植物体内含有较强的活力，在培养时利于培养，并且由于植物较为活跃，其内部的抗菌能力也会相对较强。再加上在这个时间段细菌还没有活跃，因此在培养时能够增加培养的成功率。在选择植物的种类时应当选择无毒的植株，如果不存在无毒植株则应当进行处理，通过技术手段培育出无毒植株然后再选择使用。

2.1.2 做好植物的杀菌处理工作

在选择好植物以后，应当对于选择的植物进行杀菌消毒处理，最大程度上消除植物外表的细菌与病毒，从而提高培养的成活率。在进行灭菌时一般会进行表面灭菌与深灭菌两个步骤的处理。表面灭菌是将采摘的植物体在洗净以后进行表面的杀菌处理，并将其裁剪成为适宜的大小。等到裁剪完成以后就进行深灭菌处理，表面灭菌尽管能够去除植株表面的细菌，但是植物内部的细菌却无法祛除，这种情况下就需要进行深灭菌处理。深灭菌处理是以消毒液、真空减压、水浴、抗生素、磁力搅拌、灼烧以及超声波振动等方式来实现对于细菌的深层灭杀。

2.2 外因污染的防治措施

2.2.1 确保接种环境的无菌

在进行植物组织的培养接种之前应当先进行操作环境的杀菌处理，确保操作环境的无菌。在进行操作环境的处理时首先是以酒精来对于室内的地面环境以及操作台进行杀菌处理，然后以紫外线对于空气中的细菌进行灭杀。对于操作室应当定期进行杀菌处理，并控制室内的湿度确保湿度在70%左右。

2.2.2 操作人员应当严格安装无菌操作流程操作

在进行植物组织培养的接种过程中，操作人员的操作将会直接影响到最终的培养结果。对于操作人员应当严格的安装无菌的操作规范进行操作，操作人员在操作之前应当穿好工作服以及工作帽、手套、口罩以及鞋套等设备，并做好全身的消毒，确保在进行操作时是处于一个无菌的环境之中的。在进行接种操作的过程中应当尽量避免打开操作间的门窗，如果接种的周期较长，不得不离开操作间则应当定期进行操作间的杀菌消毒处理，并且操作人员在每次出入操作间之前均应当做好相应的杀菌消毒。

2.2.3 确保培养器材以及材料的质量

在进行植物组织培养的过程中一定要确保植物组织培养的质量，在接种的过程中确保选中的接种植株的质量，如果发现植株存在污染的情况则应当在第一时间将其处理掉。避免由于植株的污染导致接种后影响成功率。此外由于很多的设备在长期的放置以后会发生松动，从而导致一些原本密闭的设备内部发生老化，从而影响设备内部的洁净度。对于这样的设备应当做好前期的检查工作，避免由于设备的污染导致接种组织的污染。

2.2.4 合理添加抗生素

在操作过程中，如果严格的安装上述的方法进行操作，从理论上而言应该不会发生外因污染了，但是在实际的培育过程中发现由于培养架上的细菌以及螨虫的滋生会对于培养基造成一定的污染，因此在实际的操作中还会选择在培养基中添加一定的抗生素来实现对于细菌的抑制，避免其污染培养基。

抗生素在培养中的应用在很久以前就被应用与动物细胞的培养中，而在植物组织的培养过程中还尚处于一个初期阶段，在进行植物组织培养的过程中添加抗生素作为一项可行的措施但是还需要进行一定的探究。尽管使用抗生素能够有效的灭杀细菌，确保培养的效率，但是却无法确保抗生素会不会对于植物组织的生长与发育产生影响，并且在培养过程中抗生素的浓度以及种类均需要进行相应的研究。

3 植物组织培养中污染苗的抢救

细菌被污染后，由于细菌繁殖靠芽孢，细菌不会弥散整个空间，因此只要及时发现，将材料上部未感菌部分去除转接，材料仍然可以用；但若真菌被污染，则必须经高温、高压灭菌后扔掉，即使仅形成菌丝，因为菌丝能到达材料内部，真菌污染是灭绝性的。

用抗生素等杀菌剂处理，虽有不少报道，但至今未发现有抗生素能对各种菌都有效，并且常会影响植物材料的正常生长分化。有的另一些药剂虽杀菌效果好，但往往容易引起盐害，无法利用。对已污染的培养物，有时因植物材料难得或重新发生要花费很多时间，也可切取较大植株重新消毒接种。分别用400万、600万单位/L青霉素无菌水溶液浸泡银白杨组织培养细菌污染苗40min以上，可有效防治组织培养中的细菌污染。处理过的苗继代培养时，不再重复出现细菌污染现象，且苗分化能力强，生根培养时根系发达，移栽成活率高。研究证明，如果继代培养中只有真菌污染，采用3%多菌灵无菌液浸泡0.5h以上即可，用无菌水冲洗后接种或不用无菌水冲洗直接接种都可消除真菌污染。如果在细菌污染和细菌、真菌同时污染的情况下，可采用HgCl2消毒法把污染培养苗切割成较长茎段作外植体，用自来水冲洗0.5h，再在超净工作台上用乙醇和HgCl2进行短时间处理，即可再度建立无菌苗培养体系。