人参皂苷对波动性高血糖模型大鼠动脉HO-1、γ-GCS表达的影响

骆阳阳黄 琦冯小红

人参皂苷对波动性高血糖模型大鼠动脉HO-1、γ-GCS表达的影响

骆阳阳1黄 琦2冯小红2

目的观察人参皂苷对波动性高血糖模型大鼠动脉血红素氧合酶-1（HO-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）表达的影响。方法 将48只雄性SD大鼠随机分成正常对照组（n=8）和糖尿病模型组（n=40）。高脂饲料喂养糖尿病模型组大鼠2周后用小剂量链脲佐菌素（STZ）诱导建立糖尿病大鼠模型，之后随机分为稳定性高糖组（n=8）和波动性高糖组（n=32），波动性高糖组错时注射葡萄糖、胰岛素制备血糖波动大鼠模型。2周后，将波动性高糖组大鼠随机分为人参皂苷低剂量组[14mg/（kg·d）]、人参皂苷中剂量组[28mg/（kg·d）]、人参皂苷高剂量组[56mg/（kg·d）]及波动性高糖空白组，每组8只，予人参皂苷低、中、高剂量干预相对应的模型组8周。实验结束后取大鼠动脉组织，采用Rt-PCR、Western blot测定HO-1、γ-GCS mRNA及蛋白表达。结果与正常对照组比较，糖尿病模型组HO-1、γ-GCS mRNA及蛋白表达明显增加（均P＜0.05）；与稳定性高糖组比较，波动性高糖空白组、人参皂苷给药组（低、中、高）HO-1、γ-GCS mRNA表达均明显增加[（19.66± 1.20，15.53±0.87），（21.72±2.27，18.85±1.93），（23.82±0.50，21.65±2.17），（25.90±1.13，26.30±1.68）比（17.30±0.56，12.50±0.97），均P＜0.05]，蛋白表达量均明显增加[（64.78±0.25，67.21±0.68），（77.34± 0.29，83.48±0.43），（82.65±0.29，94.39±0.22），（92.71±0.20，107.73±1.28）比（63.28±0.29，59.20± 0.66），均P＜0.05]；与波动性高糖空白组比较，人参皂苷给药组（低、中、高）HO-1、γ-GCS mRNA表达均明显增加 [（21.72±2.27，18.85±1.93），（23.82±0.50，21.65±2.17），（25.90±1.13，26.30±1.68）比（19.66±1.20，15.53±0.87，均P＜0.05]，蛋白表达量均明显增加 [（77.34±0.29，83.48±0.43），（82.65± 0.29，94.39±0.22），（92.71±0.20，107.73±1.28）比（64.78±0.25，67.21±0.68），均P＜0.05]；与人参皂苷低剂量组比较，人参皂苷中、高剂量组HO-1、γ-GCS mRNA表达明显增加[（23.82±0.50，21.65±2.17），（25.90±1.13，26.30±1.68）比（21.72±2.27，18.85±1.93），均P＜0.05]，蛋白表达量明显增加[（82.65± 0.29，94.39±0.22），（92.71±0.20，107.73±1.28）比（77.34±0.29，83.48±0.43），P＜0.05]；与人参皂苷中剂量组比较，人参皂苷高剂量组HO-1、γ-GCS mRNA表达明显增加 [（25.90±1.13，26.30±1.68）比（23.82±0.50，21.65±2.17），均P＜0.05]，蛋白表达明显增加[（92.71±0.20，107.73±1.28）比（82.65± 0.29，94.39±0.22），均P＜0.05]。结论 人参皂苷可增加波动性高血糖模型大鼠HO-1、γ-GCS mRNA及蛋白表达水平，减轻血管内皮损伤，可能降低波动性高血糖大鼠机体的氧化应激水平，提高抗氧化能力，对波动性高血糖所导致的动脉病变有一定保护作用。

大鼠；波动性高糖；人参皂苷；动脉；血红素氧合酶-1；γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养条件 6～8周龄雄性SPF级

SD大鼠48只，体质量160～180g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供[SCXK（沪）2008-0016]。温度（20±2）℃，相对湿度50%～60%，光照12h明暗交替，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心[SYXK（浙）2008-0115]。

1.2 药品及仪器 人参皂苷粉末（由浙江中医药大学中药研究室提供）；超短效胰岛素诺和锐（丹麦诺和锐）；链脲佐菌素；血糖试纸及血糖仪（德国罗氏）；自制高脂饲料：基础饲料69.5%、蔗糖10%、猪油10%、胆固醇0.5%、蛋黄10%。

1.3 方 法

1.3.1 糖尿病动物模型制备 将48只雄性SD大鼠随机分成正常对照组8只和糖尿病模型组40只。普通饲料喂养正常对照组，高脂饲料喂养糖尿病模型组大鼠。2周后所有大鼠禁食不禁水16h，糖尿病模型组大鼠予小剂量链脲佐菌素（STZ）35mg/kg腹腔注射诱导建立糖尿病模型，造模1周后，禁食不禁水16h，测空腹血糖为15～20mmol/L为模型制作成功。

1.3.2 血糖波动模型制备 将40只糖尿病模型大

鼠随机分为稳定性高糖组（n=8）和波动性高糖组（n= 32），波动性高糖组大鼠错时注射葡萄糖、胰岛素制备血糖波动大鼠模型。正常对照组大鼠给予腹腔注射生理盐水0.375g（/kg·d）作为对照。稳定性高糖组大鼠定时给予腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.375g/ （kg·d）。波动性高糖组定时给予腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.375s（/kg·d），错时30min后给予腹腔注射超短效胰岛素类似物诺和锐，造成1天中血糖值大幅度波动模型，使其血糖值在高血糖和低血糖间反复漂移，注射后30min测血糖，连续6周。波动性高糖组血糖波动幅度（AGE）＞1SD为有效波动。制做血糖波动模型2周后，将波动性高糖组再随机分为人参皂苷低剂量组、人参皂苷中剂量组、人参皂苷高剂量组及波动性高糖空白组，各8只。药物干预组予人参皂苷低、中、高剂量[14mg、28mg、56mg（/kg·d）]干预8周，波动性高糖空白组予等量生理盐水作对照。1.4 标本采集及指标测定 实验结束后所有大鼠禁食不禁水12h，予10%水合氯醛1ml/kg腹腔注射麻醉，处死大鼠后取部分主动脉组织，运用RT-PCR、Western blot检测波动性高糖及人参皂苷干预对细胞内HO-1、γ-GCS mRNA和蛋白的表达。

2 结 果

2.1 一般情况 正常对照组大鼠饮食水，尿量正常，体质量逐渐增加，毛色白而有光泽。糖尿病模型组大鼠给予自制高脂饲料饮食后，开始体质量增加明显，造模后稳定性高糖组大鼠出现多饮、多尿、多食，症状逐渐加重，毛色易脏无光泽，精神萎靡，对外界反应迟钝，行动迟缓，进食减少，尿液腥臊味加重，尾部破溃糜烂，多数大鼠体质量明显减轻。波动性高糖空白组较稳定性高糖组症状更明显，人参皂苷低中、高剂量组大鼠较两模型组大鼠精神明显好转，反应较灵敏，活动力较强，毛色较光泽，尿液腥臊味减轻，尾部破溃部位好转有结痂，体质量较两模型组亦明显增加。

2.2 各组大鼠动脉组织HO-1、γ-GCS mRNA表达比较 与正常对照组比较，稳定性高糖组、波动性高糖空白组及人参皂苷高、中、低剂量给药组大鼠动脉组织HO-1、γ-GCS mRNA均明显增加（P均＜0.05）；与稳定性高糖组比较，波动性高糖空白组、人参皂苷高、中、低剂量给药组HO-1、γ-GCS mRNA明显增加（P均＜0.05）；与波动性高糖空白组比较，人参皂苷高、中、低剂量给药组HO-1、γ-GCS mRNA表达明显上升（P均＜0.05）；与人参皂苷低剂量组比较，人参皂苷中、高剂量组HO-1、γ-GCS mRNA明显升高（P均＜0.05）；与人参皂苷中剂量组比较，人参皂苷高剂量组HO-1、γ-GCS mRNA表达量明显增加（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 各组大鼠动脉组织HO-1、γ-GCS mRNA表达量比较（±s）

表1 各组大鼠动脉组织HO-1、γ-GCS mRNA表达量比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与稳定性高糖组比较，#P＜0.05；与波动性高糖空白组比较，▲P＜0.05；与人参皂苷低剂量组比较，△P＜0.05；与人参皂苷中剂量组比较，●P＜0.05；HO-1：血红素氧合酶-1；γ-GCS：γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

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2.3 各组大鼠动脉组织HO-1、γ-GCS蛋白表达比较 与正常对照组比较，稳定性高糖组、波动性高糖空白组、人参皂苷高、中、低剂量给药组大鼠动脉组织HO-1、γ-GCS蛋白表达均明显增加（均P＜0.05）；与稳定性高糖组比较，波动性高糖空白组、人参皂苷高、中、低剂量给药组HO-1、γ-GCS蛋白表达明显增加（均P＜0.05）；与波动性高糖空白组比较，人参皂苷高、中、低剂量给药组HO-1、γ-GCS蛋白表达有明显上升（均P＜0.05）；与人参皂苷低剂量组比较，人参皂苷中、高剂量组HO-1、γ-GCS蛋白表达量明显增加（均P＜0.05）；与人参皂苷中剂量组比较，人参皂苷高剂量组HO-1、γ-GCS蛋白表达量明显增加（均P＜0.05）。见表2、图2。

3 讨论

随着对糖尿病研究的不断深入,人们己逐渐认识到糖尿病的本质是血管病变,内皮功能失衡是血管病变发生和发展的始动和核心环节[4]，且与高血糖状态下内皮细胞发生氧化应激密切相关。近年研究表明，波动性高血糖相对于持续性高血糖更能促进糖尿病患者慢性血管并发症的发生与发展，从而成为新近糖尿病血管并发症防治领域的一个研究热点[5]。本实验通过人参皂苷对波动性高血糖大鼠模型的干预，显示波动性高糖组动脉HO-1、γ-GCS mRNA及蛋白表达明显高于稳定性高糖组，且人参皂苷治疗后其基因表达进一步增加。

图1 高血糖及人参皂苷对氧化应激下HO-1、γ-GCS mRNA表达的影响

表2 各组大鼠动脉组织HO-1、γ-GCS蛋白表达量比较（x±s）

图2 高血糖及人参皂苷对氧化应激下HO-1、γ-GCS蛋白表达的影响

高血糖通过氧化应激诱导组织和血管疾病损伤。氧化应激是高活性分子例如活性氧簇（ROS）和活性氮物种（RNS）的过度形成或清除不足形成的。氧化应激反应产生的最初效应是诱导机体一系列抗氧化基因的表达，这些基因中有些表达抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶如血红素加氧酶-1（HO-1），γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（y-GCS）、NAD（P）H：醌氧化还原酶1 （NQO1）等，能促使化学毒性物质和ROS解毒，防止自由基的产生，促进细胞存活[6]。HO-1是血红素降解的限速酶,其抗氧化功能一方面与其阻止游离血红素参与氧化反应有关，另一方面，HO-1及其酶解产物胆红素、CO共同发挥着抗氧化、抗炎、抑制细胞凋亡等作用，广泛参与组织细胞的抗氧化应激损伤，是机体最重要的内源性保护体系之一[7]。在某些抗氧化酶出现显著增加之前，HO-1表达水平就已经显著增高，提示HO-1可能是氧化损伤的一个早期生物标志物[8]。

γ-GCS是体内还原型谷胱甘肽（GSH）合成的限速酶，是一个由重链（γ-GCSh）和轻链（γ-GCSl）组成的二聚体。增加γ-GCS的含量和活性，可以促进GSH的合成，增强组织细胞抗氧化应激的能力[9]。本实验中，糖尿病模型组动脉HO-1、γ-GCS mRNA及蛋白表达均较正常对照组有所增加，波动性高血糖大鼠组上述指标浓度的增加更为明显，说明波动性高血糖大鼠机体内氧化应激水平增高，诱导血管内皮细胞凋亡，最终导致主动脉的病变。

糖尿病中医称为“消渴症”，其病机为阴津亏虚，燥热偏胜，治法是清热润燥、养阴生津。人参治疗“消渴”早有记载。《神农本草经》谓人参能“主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智。久服，轻身延年”。人参主要活性成分人参皂苷被认为是发挥降血糖作用的主要活性物质[10]。韩国学者Lee 等[11]研究发现，采用多种抗氧化实验方法，如总抗氧化活性、还原能力、游离基清除、脂质过氧化实验，证明人参皂苷能够清除ROS，是一种优良的抗氧化剂。临床研究亦证实人参皂苷在防治糖尿病及其并发症方面具有确切的临床疗效[12-15]。本实验结果表明不同浓度人参皂苷治疗组均可不同程度地增高动脉HO-1、γ-GCS mRNA及蛋白表达水平。

综上所述，人参皂苷可增高波动性高血糖大鼠动脉HO-1、γ-GCS表达水平，抑制氧化应激，提高机体抗氧化的能力，减少氧化应激所致的内皮细胞损伤，对波动性高血糖导致的动脉病变有一定的保护作用。

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（收稿：2016-03-03 修回：2016-05-12）

Ginsenoside on Arterial HO-1 and γ-GCS Expression in Rats with Fluctuating Hyperglycaemia

LUO Yangyang1,HUANG Qi2,FENG Xiaohong2.1 The First Clinical College,Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou(310000),China;2 Department of Endocrinology,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310000), China

ObjectiveTo investigate the effects of ginsenoside on arterial hemeoxygenase-1（HO-1）and γ-glutamylcysteine synthetase（γ-GCS）expression of rats with fluctuating hyperglycaemia.MethodsForty-eight male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into healthy group（n=8）and diabetic model group（n=40）.Thediabetic rat model was established by injection of a small dose of streptozotoein after feeding them with high-fat diet for 2 weeks,then they were randomly divided into sustained high glucose group（n=8）and fluctuating high glucose group（n=32）.The model rats with high glucose fluctuation were developed by alternative intraperitoneal injection of insulin and glucose,then after 2 weeks were randomly divided into 4 groups：low[14mg/（kg·d）],middle [28mg/（kg·d）],high [56mg/（kg·d）]dosage of ginsenoside treatment group and control group,with 8 rats in each group.After 8 weeks,the expression of HO-1 and γ-GCS mRNA and protein were measured and compared.ResultsCompared with healthy group,the levels of HO-1 and γ-GCS in diabetic model group were significantly increased（P＜0.05）;compared with sustained high glucose group,the levels of HO-1 and γ-GCS mRNA in fluctuating high glucose group and ginsenoside treatment groups（low,middle,high） were significantly increased[（19.66±1.20,15.53±0.87）,（21.72±2.27,18.85±1.93）,（23.82±0.50,21.65±2.17）,（25.90±1.13,26.30±1.68）vs （17.30±0.56,12.50±0.97）;all P＜0.05];the same increase was observed in protein levels[（64.78±0.25,67.21±0.68）, （77.34±0.29,83.48±0.43）,（82.65±0.29,94.39±0.22）,（92.71±0.20,107.73±1.28）vs（63.28±0.29,59.20±0.66）;all P＜0.05].Compared with fluctuating high glucose group,the levels of HO-1 and γ-GCS mRNA in ginsenoside treatment groups（low,middle,high）were significantly increased[（21.72±2.27,18.85±1.93）,（23.82±0.50,21.65± 2.17）,（25.90±1.13,26.30±1.68）vs（19.66±1.20,15.53±0.87）;all P＜0.05],as well as the expression of protein[（77.34±0.29,83.48±0.43）,（82.65±0.29,94.39±0.22）,（92.71±0.20,107.73±1.28）vs（64.78±0.2,67.21±0.68）;all P＜0.05].Compared with low-dose ginsenoside group,middle-dose and high-dose ginsenoside groups had higher levels of HO-1 and γ-GCS mRNA[（23.82±0.50,21.65±2.17）,（25.90±1.13,26.30±1.68）vs（21.72±2.27,18.85±1.93）;all P＜0.05]and protein[（82.65±0.29,94.39±0.22）,（92.71±0.20,107.73±1.28）vs（77.34±0.29,83.48±0.43）;all P＜0.05]. Compared with middle-dose ginsenoside group,high-dose ginsenoside group had increased levels of HO-1 and γ-GCS mRNA [（25.90±1.13,26.30±1.68）vs（23.82±0.50,21.65±2.17）;P＜0.05]and protein [（92.71±0.20,107.73± 1.28）vs（82.65±0.29,94.39±0.22）;P＜0.05].ConclusionGinsenoside can increase the level of HO-1 and γ-GCS both in mRNA and protein and reduce vascular endothelial damage.Therefore ginsenoside may reduce the oxidative stress level of rats wiht high blood-glucose fluctuation,improve the antioxidant capacity,which could play a critical role in treating vascular disease caused by high blood-glucose fluctuation.

rats;fluctuating hyperglycaemia;ginsenoside;artery;hemeoxygenase-1;γ-glutamylcysteine synthetase糖尿病大血管病变是糖尿病患者致死致残的重要原因[1]。有证据表明，相对于持续性高血糖，波动性高血糖更能增加糖尿病患者发生慢性血管并发症的危险性[2]。目前，波动性高血糖致内皮细胞凋亡的机制尚未清楚，但大量研究表明，内皮细胞发生氧化应激损伤在糖尿病大血管病变的发生发展中发挥着重要作用。因此，通过运用抗氧化应激策略及控制血糖波动水平防治糖尿病大血管病变成为当今的研究热点。近年来，人参治疗和预防糖尿病及其并发症的作用受到广泛关注。人参皂苷作为人参的主要活性成分，具有较强的抗氧化和自由基清除能力[3]。本研究从氧化应激角度入手，观察人参皂苷对波动性高血糖大鼠动脉血红素氧合酶-1（hemeoxygenase-1，Ho-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamic acid and a half long glycine synthetase，γ-GCS）表达的影响。

浙江省中医药科技计划项目（No.2014ZA045）

1浙江中医药大学第一临床医学院中西医结合临床医学内分泌方向（杭州 310053）；2浙江省中医院内分泌科（杭州 310000）

黄琦，Tel：13588887338；E-mail：hq871201@163.com