HPLC法测定清火栀麦滴丸中脱水穿心莲内酯和栀子苷的含量

杨其波，丘琴，甄汉深，吴雪娇

(1.南宁市第八人民医院药剂科，广西 南宁 530003；2.广西中医药大学，广西 南宁 530001)

HPLC法测定清火栀麦滴丸中脱水穿心莲内酯和栀子苷的含量

杨其波1，丘琴2，甄汉深2，吴雪娇2

(1.南宁市第八人民医院药剂科，广西 南宁 530003；2.广西中医药大学，广西 南宁 530001)

目的 采用高效液相色谱法(HPLC)测定清火栀麦滴丸中脱水穿心莲内酯和栀子苷含量。方法采用高效液相色谱法(HPLC)，以依利特C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)为色谱柱，以甲醇-水(55:45)为脱水穿心莲内酯的流动相，250 nm为脱水穿心莲内酯的检测波长，以乙腈-水(13:87)为栀子苷的流动相，238 nm为栀子苷的检测波长对清火栀麦滴丸中脱水穿心莲内酯、栀子苷含量进行测定。结果经HPLC法测定，清火栀麦滴丸中的脱水穿心莲内酯在0.20～1.26 μg范围区间内具有良好的线性关系(r=0.999 9)，平均回收率为98.14%。清火栀麦滴丸中的栀子苷在1.59～6.46 μg范围区间内具有良好的线性关系(r=0.999 9)，平均回收率为97.36%。结论高效液相色谱法（HPLC）可以快速、简便、准确地测定清火栀麦滴丸中脱水穿心莲内酯、栀子苷的含量，值得应用。

高效液相色谱法；清火栀麦滴丸；脱水穿心莲内酯；栀子苷；含量；测定

目前，清火栀麦片被广泛应用于临床，该药主要治疗咽喉肿痛、发热、牙痛等疾病[1-2]。随着制药技术水平的提高，清火栀麦滴丸目前正逐步研制形成，该剂型相对于片剂具有诸多优点[3]。为测定清火栀麦滴丸中的脱水穿心莲内酯、栀子苷的含量，本研究采用高效液相色谱法(HPLC)进行测定，观察高效液相色谱法(HPLC)的测定效果。

1 实验材料

1.1 实验仪器 高效液相色谱仪为日立L-2000型，DAD检测器为L-2450型，WT603N电子天平(常州万泰天平仪器有限公司)，AS10200A超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，TH48SYW690真空干燥箱(北京中西远大科技有限公司)。

1.2 试剂 色谱纯甲醇、乙腈(湖北杜文化工科技有限公司)，分析纯甲醇、乙腈(湖北杜文化工科技有限公司)。脱水穿心莲内酯对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0854-200204)、栀子苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110749-200511)，穿心莲、栀子、麦冬购于南京同仁堂药材有限公司。清火栀麦滴丸来源于四川子仁制药有限公司(批号：140615国药准字Z20090052)。水为纯净水，其他试剂为分析纯。

2 方法及结果

2.1 色谱条件 脱水穿心莲内酯的色谱条件为：色谱柱为依利特C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(55:45)，检测波长为250 nm；栀子苷的色谱条件为：色谱柱为依利特C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(13:87)，检测波长为238 nm。

2.2 制作标准曲线 采用分析电子天平精密称取对照品脱水穿心莲内酯适量，使用甲醇将其溶解并定容配为浓度为0.12 mg/ml的脱水穿心莲内酯对照品溶液，利用0.45 μm的微孔滤膜将脱水穿心莲内酯对照品溶液加以滤过，分别吸取2 μl、4 μl、6 μl、8 μl、10 μl五个体积梯度进样，测定脱水穿心莲内酯的线性回归方程为：y=1 365.4x+10.216(r=0.999 9，x为脱水穿心莲内酯量，y为峰面积)，线性范围为0.20～1.26 μg。采用分析电子天平精密称取对照品栀子苷适量，使用甲醇将其溶解并定容配为浓度为0.42 mg/ml的栀子苷对照品溶液，利用0.45 μm的微孔滤膜将栀子苷对照品溶液加以滤过，分别吸取4 μl、6 μl、8 μl、10 μl、12 μl五个体积梯度进样，测定栀子苷的线性回归方程为：y= 764.36x-4.229(r=0.999 9，x为栀子苷量，y为峰面积)，线性范围为1.59～6.46 μg。

2.3 制备清火栀麦滴丸样品液 将20粒清火栀麦滴丸碾碎混匀，并采用分析电子天平精密称取约0.125 g置于2 5 ml容量瓶中，加入20 ml甲醇，用超声提取约1 h，冷却后用50%甲醇稀释至容量瓶刻度并摇匀，将清火栀麦滴丸样品液用0.45 μm的微孔滤膜滤过留存待检。

2.4 系统适应性考察 在本实验条件下样品中栀子苷保留时间约为5.6 min，其理论塔板数为6 000以上，分离度R=6.8。取缺栀子滴丸样品按上述条件测定，结果在色谱中未见栀子苷峰，表明在此条件下，栀子苷的测定不受其他成份的干扰。结果见图1、图2、图3。在本实验条件下，样品中脱水穿心莲内酯保留时间约为7.0 min，其理论塔板数为10 000以上，分离度R=21.7。取缺穿心莲滴丸样品按上述条件测定，结果在色谱中未见脱水穿心莲内酯峰，表明在此条件下，脱水穿心莲内酯的测定不受其他成份的干扰。结果见图4、图5、图6。

图1 栀子苷对照品色谱图

图2 清火栀麦滴丸样品色谱图

图3 阴性样品色谱图

图4 脱水穿心莲内酯对照品色谱图

图5 清火栀麦滴丸样品色谱图

图6 阴性样品色谱图

2.5 精密度试验 分别取10 μl脱水穿心莲内酯及栀子苷对照品溶液进行高效液相色谱法(HPLC)测定，重复进样测定6次，测得脱水穿心莲内酯及栀子苷峰面积值的RSD分别为0.81%、0.49%。

2.6 稳定性试验 取一个批次的待测样品溶液，分别按照脱水穿心莲内酯及栀子苷的色谱条件在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h取10 μl溶液进行测定，结果测得脱水穿心莲内酯及栀子苷峰面积的RSD分别为1.79%、1.40%。结果说明，脱水穿心莲内酯及栀子苷在8 h内的稳定性较好。

2.7 阴性对照试验 取10 μl不含穿心莲及栀子药材的阴性对照液进行HPLC测定，发现在脱水穿心莲内酯及栀子苷的色谱条件下均无峰形出现，说明清火栀麦滴丸中的其他成分对两种有效成分的测定无明显影响。

2.8 回收率考察

2.8.1 样品中脱水穿心莲内酯加样回收率考察 采用加样回收实验法测定，精密称取已知含量(3.29 mg/g)的同批样品分别加入脱水穿心莲内酯对照品溶液(0.637 mg/ml)1.2 ml，按上述供试品制备方法、色谱条件测定，见表1。

表1 脱水穿心莲内酯回收率结果

2.8.2 样品中栀子苷加样回收率考察 采用加样回收实验法测定，精密称取已知含量(5.13 mg/g)的同批清火栀麦滴丸样品分别加入栀子苷对照品溶液(0.36 mg/ml)1.44 ml，按上述供试品制备方法、色谱条件测定，见表2。

表2 栀子苷回收率结果

2.9 清火栀麦滴丸待测样品含量测定及结果 分别取3批清火栀麦滴丸样品，每批取三份，按照样品溶液制备方案将其制备为待测样品测试液，测定脱水穿心莲内酯和栀子苷的含量。测定结果为：三个批次的清火栀麦滴丸中脱水穿心莲内酯含量分别为：0.181 8 mg/ml，0.190 1 mg/ml，0.187 6 mg/ml；三个批次的清火栀麦滴丸中栀子苷含量分别为：0.904 2 mg/ml，0.849 5 mg/ml，0.884 1 mg/ml。见表3及表4。

表3 脱水穿心莲内酯含量测定结果

表4 栀子苷含量测定结果

3 讨 论

清火栀麦制剂主要由穿心莲、栀子、麦冬三味中药组成，该制剂的主要功效为：清热解毒、消肿凉血，目前，在临床上常用于咽喉肿痛、发热、牙痛、目赤等疾病的治疗，在治疗这些疾病中，清火栀麦制剂显示出了较好的治疗效果。目前，在2010年版《中国药典》中，清火栀麦制剂只收载有清火栀麦片[4-6]。可以看出，清火栀麦制剂的剂型相对较少。然而，剂型与药物发挥的效果具有重要关系，清火栀麦片在药物生产及临床应用中被发现有如下弊端。在药物生产中，生产片剂的药物损耗率较高，大量片剂生产后的药物粉末被浪费；药物生物利用度相对较低，在患者体内的溶解度相对较小，导致患者对药物的吸收效果不太理想。

近年来，随着社会的快速发展，医疗技术水平的提高，医学界对药物的药效要求越来越高，上世纪剂型不优、药效不好、溶解度低、生物利用度差的药物已不能满足目前的医疗需求。在社会发展的同时，制药技术也取得了迅猛发展，因剂型对药物的效果影响较大，所以药物研究在剂型设计技术上取得了不断突破，新一代的制药技术为人们的生命健康提供了有力保障。就本研究中的清火栀麦制剂而言，目前清火栀麦滴丸已被各大制药企业广泛生产，被投入临床应用。清火栀麦滴丸的主要成分仍然为穿心莲、栀子、麦冬这三味中药。清火栀麦滴丸是由药物和固体基质经加热熔融成混悬液、溶液或乳浊液后，将药液滴入至与之不相容的冷凝剂中，因表面张力作用，药液发生收缩，经冷凝处理后变成滴丸剂[7-8]。清火栀麦滴丸与其他剂型相比更具优势，目前其因具有诸多优点而被临床广泛应用，其优点有：生产工艺较为简单，要求的生产设备较为简单，节约了制药成本；生产制作流程简单，避免了多流程造成的药物损耗及其他药物混入；药物损耗小，清火栀麦滴丸的这种融化冷凝生产方法，避免了其他剂型生产过程中的大量药物粉末浪费，使得药物生产率大大提高，同时也减少了药物浪费；清火栀麦滴丸在体内的溶解度较高，患者对药物的吸收好，生物利用度较高，提高了药效。由此可见，清火栀麦滴丸是一种高效的中药剂型，正是因为它的使用优势，所以对该制剂内的药物成分进行测定具有重要意义。

清火栀麦滴丸为复方制剂，方中的干扰成分较多。本研究主要对清火栀麦滴丸中的脱水穿心莲内酯及栀子苷这两种药物成分进行测定，对两种药物成分均采用依利特C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)色谱柱，将甲醇-水(55:45)作为脱水穿心莲内酯的流动相，将250 nm作为其检测波长；将乙腈-水(13:87)作为栀子苷的流动相，将238 nm作为其检测波长。对脱水穿心莲内酯及栀子苷两种标准品进行精密度实验测定，发现精密度较为良好，又对清火栀麦滴丸的待测液进行稳定性实验检测，结果发现两种药物成分在8 h内的稳定性较好。不含这两种待测药物成分的药物阴性对照试验表明，其他药物成分对脱水穿心莲内酯及栀子苷的测定无干扰。因清火栀麦滴丸为复方制剂，用乙醇和水的提取效果均较差，所以本实验中，我们使用50%甲醇并加以超声震荡约1 h的提取，结果发现提取较为充分，提取效果较好[9-11]。

为探讨采用高效液相色谱法(HPLC)测定清火栀麦滴丸中脱水穿心莲内酯、栀子苷含量的效果，本研究采用高效液相色谱法(HPLC)对这两种药物成分进行从检测，结果发现：清火栀麦滴丸中的脱水穿心莲内酯在0.20～1.26 μg范围区间内具有良好的线性关系(r=0.999 9)，平均回收率为98.14%；清火栀麦滴丸中的栀子苷在1.59～6.46 μg范围区间内具有良好的线性关系(r=0.999 9)，平均回收率为97.36%。本研究说明，高效液相色谱法(HPLC)具有操作简便，检测快速、检测准确等优点，在清火栀麦滴丸中脱水穿心莲内酯、栀子苷的含量测定中，值得推广使用。

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Content determination of dehydrated andrographolide and geniposide in QingHuoZhiMai pills by HPLC.

YANG Qi-bo1,QIU Qin2,ZHEN Han-shen2,WU Xue-jiao2.1.Department of Pharmacy,the Eighth People's Hospital of Nanning, Nanning 530003,Guangxi,CHINA;2.Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530001,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo discuss the content of dehydrated andrographolide,geniposide in QingHuoZhiMai dripping pills by high performance liquid chromatography(HPLC).MethodsThe content of dehydrated andrographolide,geniposide was determined by HPLC,with C18 elite(4.6 mm×200 mm,5 m)as chromatographic column,methanol-water(55:45)as the mobile phase and 250 nm as the detection wavelength for dehydrated andrographolide,acetonitrile-water(13:87)as the mobile phase and 238 nm as the detection wavelength for geniposide.ResultsDehydrated andrographolide in QingHuoZhiMai dripping pill has a good linear relationship in the range of 0.20～1.26 μg(r=0.999 9), and the average recovery rate was 98.14%.Geniposide in QingHuoZhiMai dripping pill has a good linear relationship in the range of 1.59～6.46 μg(r=0.999 9),and the average recovery rate was 97.36%.ConclusionHPLC presents a fast, simple,and accurate way for detecting the content of dehydrated andrographolide,geniposide in QingHuoZhiMai dripping pills,which is worthy of clinical application.

High performance liquid chromatography(HPLC);QingHuoZhiMai dripping pills;Dehydrated andrographolide;Geniposide;Content;Determination

R917

A

1003—6350（2016）05—0756—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.024

2015-08-26)

杨其波。E-mail：8zhen@163.com