中药有效成分作用靶点研究的策略与实践＊

赵玉男，谢伟东，邢东明，余 煊，杜力军＊＊

（1.南京中医药大学基础医学院病理教研室 南京 210046；2.清华大学深圳研究生院生命与健康学部健康科学与技术重点实验室 深圳 518055；3.清华大学生命科学院药物药理研究室 北京 100084）

中药有效成分作用靶点研究的策略与实践＊

赵玉男1，谢伟东2，邢东明3，余 煊3，杜力军3＊＊

（1.南京中医药大学基础医学院病理教研室 南京 210046；2.清华大学深圳研究生院生命与健康学部健康科学与技术重点实验室 深圳 518055；3.清华大学生命科学院药物药理研究室 北京 100084）

中药治疗疾病的物质基础、药效和机制研究已较充分，然而靶点的研究进展相对缓慢，这和靶点研究本身的被动性和难度有一定关系。本文基于国内外文献报道，并结合笔者的研究实践，对此进行了较为系统的探讨。本文主要介绍三种技术路径：“线索”驱动、噬菌体展示以及亲和垂钓。并提及两种方案：酶解法和光交联法。基于这些技术方案，加强中药有效成分靶点研究的实践，将会有助于阐明中药治疗疾病的现代科学基础，有助于发展现代中药和创新中药。

中药 有效成分 作用靶点 噬菌体展示 亲和垂钓

应用现代科学技术方法，结合物质基础研究，揭示中药治疗疾病的现代科学基础，是中药药理学的主要任务之一[1]。该任务的本质是对传统中药临床疗效进行证实或证伪的一个科学过程。因此，中药药理学也是一个“假说后立”的研究，寻找证据是关键环节[2]。对于实验研究而言，药理学的证据包括物质基础、体内过程、药效、作用机制以及靶点等。在物质基础和体内过程明确的情况下，“药效-机制-靶点”可以看成是一条“证据链”，用于证实或证伪，在这条“证据链”中，靶点是重中之重。

目前，中药的物质基础（有效成分）及体内过程已较清楚，有效成分的药效和作用机制研究也比较充分，然而靶点的研究相对较少，体内作用靶点明确的有效成分寥寥无几。因此，对于中药疗效的证实或证伪而言，“证据链”是不完整的，缺少靶点这样的有力证据。为此，中药有效成分体内作用靶点研究应成为中药药理学今后的主要研究方向。然而，靶点的研究并非易事，对于少数几个靶点清楚的有效成分，其体内作用靶点发现的过程有些“偶然性”。 最具代表性的是大麻素受体的发现，80年代末，Matsuda等人将从大鼠大脑皮质cDNA文库中分离到的一个cDNA（SKR6）稳定转染到CHO细胞中后，体外与大麻类物质孵育时发现有反应而偶然发现的。“偶然性”其实意味着靶点发现的被动性和困难性，这可能是当前靶点研究成果相对匮乏的原因。为了提高靶点发现的效率，必须要有一套可主动发现有效成分体内作用靶点的技术路径。当前，国内外科研人员主要提出了3种解决方案，我们将其归纳为：“线索”驱动（Action-Trial Leading）、噬菌体展示（Phage Display）和亲和垂钓（Pull Down）[4]等，并展开了相应的科学实践。本文将以此为主线，对于中药小分子药理作用靶点的策略进行初步论述。

1 “线索”驱动

“线索”驱动是指有效成分经体内过程、药效和作用机制研究后，研究人员根据研究得到的“线索”，推测出或假设和该有效成分可能有相互作用的蛋白质或核酸，然后采用生物技术做靶点的验证性研究。例如关于小檗碱的研究就是基于该策略，通过研究首次揭示了小檗碱的2个核酸靶点：保持mRNA稳定的Poly（A）和基因转录区的TATA box[5]，其研究路径如下所述：

1.1 小檗碱可进入细胞核

将小檗碱和PC12细胞共孵育，采用激光共聚焦显微镜，观察60 min内的动态发现：随着时间的推移，绿色荧光（小檗碱）在细胞核的位置开始出现并逐渐加强，暗示小檗碱可进入细胞核。细胞核内小檗碱的高效液相色谱定量分析进一步验证了上述的发现，时量曲线显示：小檗碱可快速进入细胞核，达峰时间约为12 h左右[6]。

1.2 小檗碱可与遗传组分相互作用

进入细胞核的小檗碱可与遗传组分发生相互作用，早先的研究显示：作为一种DNA的嵌入剂，小檗碱可与人工合成的DNA发生相互作用。课题组进一步采用荧光能量共振转移技术，验证了小檗碱可与天然的遗传组分相互作用，比如：染色质、质粒和基因组；并采用了等温滴定量热法测得小檗碱与染色质、质粒以及基因组的平衡解离常数（K）分别为：15 672、97 380和117 147[6]。

1.3 保持mRNA稳定的Poly（A）

小檗碱虽可与遗传组分相互作用，但具体作用位点不清楚。课题组在一项小檗碱抗脑缺血再灌注的药效学研究中发现：小檗碱体外可拮抗氧糖剥夺诱导的PC12细胞凋亡，机制与其阻止模型细胞内Retinoblastoma（Rb）蛋白表达的下降有关；此外，对于Rb蛋白敲除的PC12细胞系，小檗碱丧失了其抗细胞凋亡的作用；这两个实验结果提示，Rb蛋白是小檗碱抗氧糖剥夺药效的作用环节。

进一步研究发现，小檗碱拮抗模型细胞Rb蛋白表达下降的机制和Rb的mRNA有关。然而，小檗碱并不能增强Rb的转录活性，说明小檗碱不能增加Rb的mRNA表达水平。因此，课题组推测小檗碱抗模型细胞内Rb mRNA下降的机制可能与其能保持Rb mRNA的稳定有关。上述推测得到了体外实验的证实，研究发现：在采用放线菌素D抑制基因转录的模式细胞中，氧糖剥夺可明显增加Rb mRNA降解的速度；小檗碱不但能减弱模式细胞在正常培养状态下Rb mRNA降解的速度，还能拮抗氧糖剥夺导致的Rb mRNA降解速度的增加。

众所周知，mRNA的Poly（A）尾巴与其稳定性密切相关，那么小檗碱稳定Rb mRNA的机制是否与Poly（A）有关。课题组分别构建了带Poly（A）和不带Poly（ A）的Rb表达质粒，带Pol（A）的Rb表达质粒转染细胞后，其胞内Rb mRNA的水平远高于不带Poly（ A）的Rb表达质粒。而且，小檗碱只对带Poly（A）的Rb mRNA有作用；对不带Poly（A）的Rb mRNA，无论是在正常培养状态下还是氧糖剥夺状态下，小檗碱均不能发挥其抑制mRNA降解的作用。

从抗凋亡、Rb蛋白、Rb mRNA、mRNA的稳定到Poly（A），根据实验结果推测Poly（A）是小檗碱的核酸作用靶点。最后，课题组采用荧光光谱（FRET）及其二维核磁共振谱（2D-NMR）技术确证小檗碱和Poly（A）之间存在直接的物理相互作用，Poly（A）是小檗碱的核酸作用靶点[5,7]。

1.4 基因转录区的TATA box

课题组在另一项小檗碱抗热应激的药效学研究中发现：小檗碱可拮抗热应激引起的小鼠体温升高，抑制模型动物过多分泌热休克蛋白70（HSP70）；而且，HSP70的蛋白水平与其mRNA水平呈正相关性，提示小檗碱抑制HSP70的蛋白表达与HSP70的mRNA密切相关[8]。

进一步研究发现，小檗碱可通过直接抑制HSP70的转录活性，降低HSP70的mRNA表达，进而导致HSP70蛋白水平的下降。值得注意是，小檗碱对Rb的转录活性并没有影响。这两个试验结果提示，小檗碱抑制HSP70的转录活性可能与转录系统中的酶活性无关，而与基因启动子区的碱基序列有关，否则不会出现这种选择性转录活性降低的现象。分析HSP70和Rb基因启动子区的碱基序列发现，HSP70基因启动子区含TATA box，而Rb基因启动子区含GC box，不含TATA box，那么小檗碱抑制HSP70的转录活性是否与TATA box有关。课题组分别构建了启动子区含TATA box和GC box的HSP70表达质粒，转染细胞后小檗碱只对启动子区含TATA box的HSP70质粒表达有抑制作用，而对启动子区含GC box的HSP70质粒表达无明显影响，表明小檗碱抑制HSP70的转录活性与TATA box相关[5]。

至此，从抗热应激、HSP70蛋白、HSP70 mRNA、mRNA的转录到TATA box，课题组同样在众多“线索”的指引下，高度怀疑TATA box是小檗碱的核酸作用靶点。与Poly（A）一样，课题组最后采用FRET技术确证小檗碱和TATA box之间存在直接的物理相互作用，TATA box是小檗碱另外一个核酸作用靶点；并基于电泳迁移率变动分析（EMSA）和免疫共沉淀技术（ChIP），发现小檗碱和TATA box结合后，可干预TATA box和TATA结合蛋白（TBP）之间的结合，进而干扰基因转录[6]。

2 噬菌体展示

噬菌体展示技术最早建立于1985年，其原理是以噬菌体为载体，将外源基因片段克隆至噬菌体外壳蛋白基因中，并以融合蛋白的形式表达于噬菌体外壳。噬菌体本身的粘附、侵入及整合功能并不会因外源性DNA片段的插入而受到影响，同时外源片段在噬菌体外壳的表达也保持了其原有的三维空间构像。大量的这样表达有外源片段的噬菌体就组成了噬菌体展示文库。噬菌体展示文库提供了大量的蛋白质/多肽结构信息，实现了高通量和高效率筛选的可能性，已广泛运用于抗原表位分析、分子相互作用、单克隆抗体的制备、疫苗研制及药物筛选等多个研究领域[9]。近些年来，陆续有研究人员提出将噬菌体展示技术运用到小分子药物体内靶点蛋白的发现上[10-12]。

2.1 生物淘洗

噬菌体展示技术的筛选原理又称“生物淘洗”，该技术是利用分子间的特异性亲和力进行的。首先，将待研究的目标分子（小分子或大分子）通过共价键固定在载体上，加入噬菌体文库，令其充分相互作用进行结合选择；在此过程中，可与目标分子特异性结合的噬菌体克隆将结合到载体上，未结合的噬菌体克隆被直接洗去。然后，用缓冲液将结合的噬菌体克隆洗脱下来，收集洗脱的噬菌体克隆感染宿主进行扩增，获得的噬菌体再次重复上述的结合筛选。如此经过“吸附-洗脱-扩增”循环式的3-5轮筛选，最终洗脱得到的噬菌体克隆经初步结合实验鉴定后，分别挑取单个克隆进行基因序列分析，根据测序结果分析得到其对应的基本氨基酸序列，即为可与目标分子有特异性结合的氨基酸序列。最后，在生物信息学的帮助下，分析生物体内含有上述氨基酸序列的蛋白质，这些蛋白质即有可能是目标分子在生物体内的靶蛋白。

1999年，Rodi等[13]较早利用上述噬菌体展示技术，对抗癌药物紫杉醇进行生物淘选，最终鉴定Bcl-2可能是紫杉醇在体内的作用靶点。Yu等[14]将地塞米松固定在Eppendorf管壁上，4轮淘洗后鉴定得到了与其结合的氨基酸序列，经GenBank检索发现具有该氨基酸序列的蛋白质为细胞色素c氧化酶亚单位Ⅲ和白蛋白，从而发现了糖皮质激素体内其它可能存在的作用位点。Van Dorst等[15]采用T7 cDNA噬菌体展示文库淘选，经BLAST同源检索后，既得到了双酚A已知的作用靶点α-微管蛋白，同时也发现了双酚A未知新的疑似作用靶蛋白-转录相关酸性卷曲蛋白3（Transforming Acidic Coiled-Coil Containing Protein 3，TACC3）。2011年，Van Dorst等[16]采用了相同的技术研究了17β雌二醇体内的蛋白靶点，发现了两个可能的未知靶点：beclin 1和ATP合成酶F0亚单位6。类似的研究还包括对全氟辛烷磺酸[17]、环孢霉素A[18]、甲氨蝶呤[19]、伊立替康[20]和扑热息痛[21]等单体小分子药物，以及三水白虎汤[22]等多组分有效成分的研究上。

作为最早用来主动发现小分子体内作用靶点的方案，噬菌体展示中的生物淘洗法已有多个成功的实例报道。然而，从对糖皮质激素和雌激素的研究结果来看，该方案并未发现大家所熟知的糖皮质激素受体或雌激素受体，因此有一定的局限性，这可能和噬菌体展示文库的容量大小有关。噬菌体展示方案在2010年左右迎来一个研究高峰；不过自2013年起至今，在Pubmed上检索“phage display”已鲜有最新研究报道。此外，通过噬菌体展示方案得到的疑似靶蛋白，更多都停留在疑似阶段，很少有进一步的小分子与靶点之间的结构和功能确证性研究。此为其局限之处。

2.2 功能基团荧光展示

上述生物淘洗法通过小分子化合物上的功能基团与固相载体偶联，也会导致功能基团周边的空间结构受到阻碍，因此就不会“垂钓”出与该空间结构有亲和力的噬菌体克隆，功能基团荧光展示法可使小分子化合物在自由状态下与噬菌体文库进行结合，理论上可弥补该不足。尽管该方法目前还未出现成功的案例报道，但它已经开始在一些实验室进行实践，原理如下：

首先，如果小分子化合物与噬菌体克隆发生特异性结合，那么该小分子化合物有可能会屏蔽掉多肽上结合处的某些功能基团，比如氨基、羧基或者酚羟基等。然后，用化学反应的方法将那些没有被屏蔽的功能基团保护起来。接着，将小分子化合物从结合的噬菌体克隆上洗脱下来，暴露出那些活性功能基团，再用化学反应的方法将这些功能基团连接上荧光物质。最后，将这些有荧光的噬菌体克隆挑选出来感染宿主进行扩增，获得的噬菌体再次重复上述的流程。如此经过3-5轮循环式筛选，最终可得到与小分子化合物特异性结合的噬菌体克隆，剩下的步骤同上述生物淘洗法。

图1 R1位点含糖基的人参皂苷单体和含氨基的树脂偶联后示意图

3 亲和垂钓

在生物分子中，有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和垂钓就是根据这个原理，将目标分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质直接流出，从而与目标蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。

中药有效成分为小分子化合物，可作为“配体”或者“底物”直接连接（连接原理可参照小分子半抗原/人工抗原的制备[23]）或通过引入标签间接连接到固相载体上（比如：小分子引入生物素标签，再和有亲和素的固相载体连接），然后通过亲和层析的方法“垂钓”出与其有亲和作用的蛋白质群（在“垂钓”出靶蛋白的同时也会带出与靶蛋白有亲和力的其它蛋白质），再通过1维（1D）或者2维（2D）蛋白质凝胶电泳进行分离，挖取单个蛋白质斑点进行质谱鉴定。最后，根据鉴定的结果，采用分子间相互作用研究技术对鉴定出的蛋白质和目标小分子进一步做亲和力分析，从而发现可与目标小分子直接发生相互作用的蛋白质靶点。自蛋白质质谱鉴定商业化运作后，断续出现采用该技术探索小分子体内蛋白质作用靶点的报道。2007年，Wulff等[24]采用生物素标签将（+）-avrainvillamide连接到固相载体上“垂钓”细胞裂解液中的蛋白质，基于蛋白质质谱分析、Werstern Blot、竞争性亲和抑制以及基因突变等技术，鉴定出（+）-avrainvillamide细胞内的一个作用靶点为核仁磷酸蛋白（Nucleophosmin）。2015年，Wang等[25]同样采用生物素标签将青蒿素连接到固相载体上，从疟原虫中“垂钓”出多达124个疑似蛋白质作用靶点，并经荧光标签技术确认血红素可能是青蒿素对寄生虫产生杀伤作用的关键环节。

本课题组采用小分子化合物和载体直接连接的方法，探索了人参皂苷抗疲劳药效的体内蛋白质作用靶点[26,27]。分子间偶联通常会导致小分子偶联处的空间结构受到阻碍，因此难以“垂钓”出与该空间结构有亲和力的蛋白质。由图1可知，如果通过R1位点的糖基采用高碘酸氧化的方法和固相载体偶联，那么R1位点周边的空间结构将会被屏蔽。同理，如果通过R3位点的糖基和固相载体偶联，那么R3位点周边的空间结构将会被屏蔽，但是R1位点周边的空间结构会充分暴露。故我们推测，可以采用混合皂苷作为“配体”或者“底物”有效解决空间结构屏蔽，以实现人参皂苷的空间结构充分暴露。为此，我们采用高纯度的人参总皂苷作为偶联对象，通过亲和树脂的制备、骨骼肌匀浆液亲和“垂钓”、蛋白质电泳分析以及蛋白质质谱鉴定，发现8个疑似蛋白（表1）。

表1 蛋白质质谱鉴定各凝胶条带所得疑似蛋白质

由于在人参总皂苷亲和“垂钓”脑组织匀浆实验中也鉴定出了肌酸激酶，本课题组选定肌酸激酶，采用生物膜干涉技术优先对其进行确认。采用ForteBio的分子间相互作用仪Octet RED96研究了人参皂苷单体、苷元与肌酸激酶（MM型和MB型）的相互作用，获得其结合常数、解离常数和亲和力等动力学参数。结果显示：仅原人参二醇和肌酸激酶有一定的分子间相互作用，进一步结合解离动力学研究得出：原人参二醇与肌酸激酶（MM型）的亲和力（KD）值为2.53×10-5,与肌酸激酶（MB型）的亲和力（KD）值为9.23×10-6。上述结果提示我们，尽管肌酸激酶是人参总皂苷偶联树脂亲和“垂钓”而得，但实际上和肌酸激酶有较强相互作用的是原人参二醇。

原人参二醇与肌酸激酶相互作用之后，会对肌酸激酶产生何种效应，我们初步分析了原人参二醇体外对肌酸激酶活性的影响，发现原人参二醇与肌酸激酶相互作用后可增加该酶的活性，可能是肌酸激酶的激活剂。由于肌酸激酶是一个与细胞内能量转运、肌肉收缩以及ATP再生有直接关系的重要激酶，因此肌酸激酶活性的增加将有助于机体抗物理疲劳，再加上人参总皂苷中的二醇型皂苷可在体内代谢成原人参二醇，从而可合理解释人参总皂苷为什么可以抗疲劳。不过，该解释需要体内外实验的证实，目前该部分的研究正在进行中。

总之，亲和“垂钓”方案与蛋白质质谱鉴定技术的成熟密不可分，虽已有一些成功的案例报道，但整体也还处于技术路线优化探索的阶段。

4 小结

综上所述，除了偶然发现之外，我们也可以依靠“线索”或者筛选的方法来主动探索中药有效成分体内的作用靶点。“线索”驱动方案相对耗时、耗力，并需要确保每个“线索”的真实性和可靠性，在逻辑思维的指引下向作用靶点逐渐靠近。从原理上来看，噬菌体展示和亲和垂钓是带有筛选性质的两套完全不同的技术方案；从发现高度疑似靶蛋白的角度上来看，这两个方案相对快速和高效。

除此，目前还有几种处于探索阶段的技术方案，比如：酶解法[28,29]和光交联法[30]。所有这些技术方案最初应用的出发点可能并不是为了小分子作用靶点的发现，但经适当调整后用于中药有效成分作用靶点的探索均是可行的。因此，基于这些技术方案，加强实践，一定能揭示中药有效成分体内的作用靶点，如此将有助于阐明中药作用机制，及其相关药物的研究与开发。

1 邓文龙. 中药药理学研究的现状与问题讨论. 中药药理与临床，2010, 26(5): 1-3.

2 邓文龙. 中药药理学也是一个假说后立的研究. 中药药理与临床, 2011, 27(3): 123-126.

3 Matsuda L A, Lolait S J, Brownstein M J, et al. Structure of a cannabinoid receptor and a functional expression of the cloned cDNA. Nature, 1990, 346(6284): 561-564.

4 王冬尧,陈啸飞,曹岩,等. 生物活性小分子的靶标鉴定. 中国新药杂志, 2015, 24(10): 1119-1123.

5 Yuan Z Y, Lu X, Lei F, et al. TATA boxes in gene transcription and poly (A) tail in mRNA stability: new perspective on the effects of berberine. Sci Rep, 2015, 5: 18326.

6 Kheir M M . Comprehensive study in the inhibitory effect of berberine on gene transcription, including TATA box. PLoS One, 2011, 6(8): e23495.

7 Chai Y S, Yuan Z Y, Lei F, et al. Inhibition of retinoblastoma mRNA degradation through poly (A) involved in the neuroprotective effect of berberine against cerebral ischemia. PLoS One, 2014, 9(6): e90850.

8 Jiang J F, Wang Y G, Hu J, et al. Novel effect of berberine on thermoregulation in mice model induced by hot and cold environmental stimulation. PLoS One, 2013, 8(1): e54234.

9 秘勇建,马志奎,赵炜疆. 噬菌体展示技术及其应用的研究进展.现代生物医学进展, 2012, 12(14): 2766-2768.

10 张芳,邱郑. 噬菌体展示技术与中药活性成分靶点蛋白筛选研究.中国中药杂志,2013, 38(14): 2264-2267.

11 Dorst B V, Mehta J, Rouah-Martin E, et al. Phage display as a method for discovering cellular targets of small molecules. Methods, 2012, 58(1): 56-61.

12 Piggott A M, Karuso P. Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display. Nat Prod Rep, 2016, 33(5): 626-636. 13 Rodi D J, Janes R W, Sanganee H J, et al. Screening of library of phage-displayed peptides identifies human Bcl-2 as taxol-binding protein. J Mol Biol, 1999, 285(1):197-203.

14 Yu X, Zhao P, Zhang W, et al. Screening of phage displayed human liver cDNA library against dexamethasone. J Pharm Biomed Anal, 2007, 45(5): 701-705.

15 Van Dorst B, Mehta J, Rouah-Martin E, et al. cDNA phage display as a novel tool to screen for cellular targets of chemical compounds. Toxicol in Vitro, 2010, 24(5): 1435-1440.

16 Van Dorst B, Mehta J, Rouah-Martin E, et al. The identification of cellular targets of 17β estradiol using a lytic (T7) cDNA phage display approach. Toxicol in Vitro, 2011, 25(1): 1435-1440.

17 Miyano Y, Tsukuda S, Sakimoto I, et al. Exploration of the binding proteins of perfluorooctane sulfonate by a T7 phage display screen. Bioorg Med Chem, 2012, 20(13): 3985-3990.

18 He Q L, Jiang H, Zhang F, et al. Simultaneous identification of multiple receptors of natural product using an optimized cDNA phage display cloning. Bioorg Med Chem Lett, 2008, 18(14): 3995-3998.

19 Takakusagi Y, Kuroiwa Y, Sugawara F, et al. Identification of a methotrexate-binding peptide from a T7 phage display screen using a QCM device. Bioorg Med Chem, 2008, 16(15): 7410-7414.

20 Takakusagi Y, Kuroiwa Y, Takagi M, et al. Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool. Bioorg Med Chem, 2008, 16(22): 9837-9846.

21 Smith M W, Smith J W, Harris C, et al. Phage display identification of functional binding peptides against 4-acetamidophenol (Paracetamol): an exemplified approach to target low molecular weight organic molecules. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 358(1): 285-291.

22 潘超,肖长虹,高燕,等. 噬菌体随机十二肽库淘选三水白虎汤作用于类风湿关节炎滑膜细胞的靶点研究. 中国免疫学杂志, 2014, 30(4): 446-448, 453.

23 赵玉男. 中药有效成分半抗原抗体应用研究进展. 中国中药杂志，2013, 38(5): 657-660.

24 Wulff J E, Siegrist R, Myers A G. The natural product avrainvillamide binds to the oncoprotein necleophosmin. J Am Chem Soc, 2007, 129(46): 14444-14451.

25 Wang J, Zhang C J, Chia W N, et al. Haem-activated promiscuous targeting of artemisinin in Plasmodium falciparum. Nat Commun, 2015, 6: 10111.

26 Zhao Y N, Wang Z L, Dai J G, et al. Preparation and quality assessment of high-purity ginseng total saponins by ion exchange resin combined with macroporous adsorption resin separation. Chin J Nat Med, 2014, 12 (5): 382-392.

27 Ouyang L F, Wang Z L, Dai J G, et al. Determination of total ginsenosides in ginseng extracts using charged aerosol detection with post-column compensation of the gradient. Chin J Nat Med, 2014, 12 (11): 857-868.

28 Lomenick B, Jung G, Wohlschlegel J A, et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS) . Curr Protoc Chem Biol, 2011, 3(4): 163-180.

29 Pai M Y, Lomenick B, Hwang H, et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods Mol Biol, 2015, 1263: 287-298.

30 Tomohiro T, Yamamoto A, TAtsumi Y, et al. [3-(Triflu-oromethyl)-3H-diazirin-3-yl] coumarin as a carbine-generating photocross-linker with masked fluorogenic beacon. Chem Commun (Camb), 2013, 49(98): 11551-11553.Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518055, China; 3. Laboratory of Molecular Pharmacology and Pharmaceutical Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

Advances in Research Approachs of Action Targets of Active Ingredients from Chinese Herbs

Zhao Yunan1, Xie Weidong2, Xing Dongming3, Yu Xuan3, Du Lijun3
(1. Laboratory of Pathological Sciences, Basic Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China; 2. Key Laboratory of Health Science and Technology, Division of Life Science & Health, Graduate School at

Nowadays, there has been many researches on the material basis, effectiveness and action mechanisms of Chinese herbs. However, the action target research of active ingredients from herbs is relatively less, which may be associated with its own passivity and difficulty of current target research. For improving the target discovery efficiency of active components, it is critical to approach some initiatives by technical routes to find targets. In this review, based on the domestic and foreign literatures and our previous researches, three different technical routes for the target discovery of active ingredients were introduced in detail, including “clue” drive, phage display and pull-down, and other two options--drug affinity responsive target stability (DARTS) and light cross-linking. Using these technical approaches, it is benefitial to clarifing the modern science basis of Chinese herbs by strengthening the target research practice of active components, and developing modern and innovative Chinese herbs.

Chinese herbs, active ingredients, action target, phage display, pull down

10.11842/wst.2016.06.012

R96

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-05-24

修回日期：2016-06-13

＊ 国家自然科学基金委青年基金项目（81303246）：脑局部糖原代谢在人参总皂苷抗应激致海马结构可塑性损伤中的作用研究，负责人：赵玉男；国家自然科学基金委重大研究计划（90713043）：基于小檗碱神经元保护作用探讨其PI3-K/AKT作用的始动位点及其信号转导，负责人：杜力军。＊＊ 通讯作者：杜力军，本刊编委，教授，主要研究方向：药理学。