天然小分子、表象药理与药物作用的机制＊

雷 帆，邢东明，严孝金，杜力军＊＊

（1.清华大学生命科学学院药物药理实验室 北京 100084；2.清华大学药学院 北京 100084）

天然小分子、表象药理与药物作用的机制＊

雷 帆1，2，邢东明1，严孝金1，杜力军1＊＊

（1.清华大学生命科学学院药物药理实验室 北京 100084；2.清华大学药学院 北京 100084）

编者按：随着中药现代药理研究的不断深入，中药复杂的药理作用不断被揭示和表述。中药中一些有效小分子作为中药的特征成分，其作用机制也不断为人们所探索和揭示。什么是“机制”、如何深入探讨中药活性小分子的作用机制，以及在多大程度上揭示其作用机制？基于此，中药药理研究的思路和技术方法显得非常重要。本专题刊登了一组由清华大学生命科学学院杜力军教授组稿的有关中药活性小分子药理研究思路与方法的系列文章，尝试对这一命题进行探讨。藉此促进各位学者对中药药理研究现状的思考、总结和提高，同时也希望该组文章对创新中药小分子药物的研究与开发有所裨益。

本文主要从天然（中药）小分子与化学合成小分子的理念异同、表象药理与特异性靶点及其作用机制的异同等方面对该类小分子成分的特点及其相关的药理学研究的一些概念进行了探讨。由于天然（中药）小分子来源的非目的性，具有体内作用靶点多样性和作用机制广泛性的特点。因此，在药理研究中，要进行相关作用靶点背景的筛选，以确定作用靶点和作用机制的相关性。最后进行作用靶点和作用机制特异性的确证。为了更好的理解和掌握小分子作用的相关性和特异性，进而促进天然（中药）小分子新药的研究，本文对此进行了较为系统深入的探讨。

天然药物 小分子 表象药理学 新药研发

随着中药及天然产物的深入研究，一些小分子单体成分不断被发现，且被开发为新药。作为单一化合物，在确证其有效性的同时，其作用机制及其作用靶点需要进行较为清晰、深入的探讨。新药审评也强调这个问题，且需要申报、研发单位表述所申报中药（天然）小分子的作用机制及靶点。人们常把筛选到的可能作用靶点、可能的作用机制与已确认的作用靶点、机制相混淆，不利于对研究对象的正确表述。因此，正确定义中药（天然药物）新药小分子确切作用靶点、机制，准确客观地表述，以及区分其与化学合成小分子在作用机制尤其是作用靶点上的不同点，将有助于深化对中药（天然）小分子药理作用的认识和研究。

1 天然小分子来源及其特征

天然小分子（Natural Small Molecules）是指非人工合成的小分子化合物，凡是从自然界生物中分离得到的单体化合物均属此类范畴。在国家食品药品监督管理局新药申请注册分类中常归为一类新药。这类小分子不同于化学合成小分子，尤其在新药研发理念上不完全一致。首先，这类小分子是自然界天然存在的，其可能产生的药理作用及相关靶点具有不确定性和未知性。而化学合成小分子，因研究前期的药物设计及有针对性的筛选，最后确定的一般是针对确定靶点具有较强生物效价的化合物。化学合成小分子一旦确定其成药性，它的作用靶点基本上是清晰且特异的，而天然小分子对机体的作用未知，靶点也不确定。因此，在天然小分子的作用靶点探究上须首先有一个相关背景筛选，之后再确定特异性靶点。

2 药物作用的表象与机制

表象（Phenotype）简单来讲就是指表面现象。一种体内的病理、生理变化的外在反映可以称之为相关的表象[1-3]。对药物来说，就是给药后受试体由此而表现出来的反应[4，5]。主要以观察所给药物在体内反应所表现的药效及其相应指标变化的药理工作，也称之为“表象药理”（Phenotype Pharmacology）[6-8]。药理研究中的活性筛选，药效确证等都属于这一范畴。表象研究只强调机体反应的客观性、准确性及其相关性，但这种反映的内在的机制不一定清楚。例如，给予一种药物后，机体会有响应，表现在某些指标或者是靶点的变化。表象所得出来的结果对受试药物来说、反映的是“相关性”（Correlation）。由于这种指标的变化是在施加某一药物后所表现出来的一系列指标变化简单归纳的结果，只是反映了药物作用机制的相关性，由此表述为该药物作用的相关机制。

药物的作用机制（Action Mechanism）指受试药物作用机体所出现相关药效的原因，而这一原因是专属性的（Specificity）。也就是说，这些变化与药效有因果关系（Logical Causal Relation；Logical Cause-Effect）。

表象与特异性靶点的区别在于，前者仅反映了相关性，而后者则是从逻辑关系上进行了因果确证。因此，后者是真正的反映了受试药物的作用机制。但是由于探讨因果关系的难度远远大于对一些结果的描述，因此多数情况下的药理研究报告采用表象方式进行描述。如果这种表象结果与实质的因果机制的相关性很大时，这种表象结果就具有重要的意义。

由此可见，由于表象结果与逻辑因果关系的结果有着本质的不同，因此我们在表达某受试药物的作用机制时一定要表达清楚是相关性，还是因果性。

由此可以看出，表象药理的关键在于所观察指标与药物作用机制之间的相关性的大小及其权重，即其所观测的指标与被研究对象自身运动规律之间的相关性的大小成为该受试药物作用机制的关键。也就是说，所测指标距离被研究对象的自身运动规律越近，该指标所能反映受试药物的作用机制的权重就越大，反之则越小。表象药理所观测指标的权重如图1所示。

图1 表象药理观测指标与药物作用机制之间关系

系统药理学（Systems Pharmacology）[9-11]或者网络药理学（Network Pharmacology）强调从整体和系统来表述药物作用的靶点和机制[12-14]。其中也存在一个表象还是特异作用机制的区别。由于这两种表述所涉及的靶点较多，进行因果关系上的验证难度较大，因此这两种论述多属于表象描述。

表象药理研究需要注意测试指标的选择。常出现的问题是研究者的主观性、指向性，即只观察研究者想要的指标，忽视问题背后的其它因素指标（将此称为“背景指标”，Background）。例如，观察一个肿瘤的新指标，并指向性的认为这一指标就是受试药物的作用靶点，而不去观察一般与抗癌活性密切相关的诸如肿瘤坏死因子（TNFα）和凋亡坏死因子（Caspase3）等抗肿瘤的背景指标。而实际上，这一受试药物对肿瘤的抑制作用很大一部分可能与诱导凋亡有关。

除此之外，表象药理研究还要分析所观察指标之间的内在逻辑关系，分析受试药物是作用于这一信号通路的上游，还是同时作用于这一信号通路的各个环节。如果我们选择单一因子作用观察受试药表象药理指标，为了证明作用这一因子的有效性，我们还要再选择该因子的下游指标同时进行观察，以反映作用于该因子的有效性。例如，观察中药小分子黄芩苷对模式识别受体TLR2/4的作用，在观察该指标表达的同时，需选取该受体下游的能反映相关效应的因子同时观察。由于TLR2/4都可以影响到TNFα表达，后者又反映了TLR表达后通过TNFα所激活的免疫炎性反应。结果表明，黄芩苷不仅抑制TLR2/4的表达，并由此抑制了TNFα的表达，因而表现出了抗炎免疫作用。如此，这种表象药理的研究就具有内在逻辑性[15]。

3 表象药理与药效学

药效学始终是新药研究的核心，在确认有效性方面具有重要意义。国家食品药品监督管理局对此有明确指导意见。但是对于小分子单体化合物除了有效性之外，常需要对其作用机制进行研究。因此，中药小分子单体的药效学分为有效性研究、机制研究两部分。对于机制研究，人们常有两种认识：一种是将相关指标进行检测，然后分析、汇总所测指标来表述其作用机制。这种方法实质上是一种筛选指标，只能说明受试药物的作用机制有相关，却不等同于机制，国外将其称之为“表象指标”。国内则有人将其称之为机制，甚至有些人还将其指标只当作“机制”，这种观点并不严谨；另一种是在表达了相关指标之后，将这些指标的内在联系进行因果关系确证，最终确定其逻辑关系，这才是真正意义上的机制研究。该研究思路需要使用各种生物技术和方法，通过阻断、敲除等方法来表明受试药物作用靶点的特异性、唯一性。

4 药物作用靶点确认

与合成小分子不同的是，天然小分子单体作用靶点未知，靶点涉及很多方面。在这一点上，天然小分子作用与中药复方一致，即靶点不确定和可能存在的多靶点。因此，在新药研究中对于靶点确认上要有一个特定范围的筛选。而不是仅仅对研究者想表达的靶点进行探讨，如此似乎受试药作用靶点很单一，很具体。但是如果扩大范围筛选的话，可以还会有许多靶点。所以，新药研究中要对所申报的临床适应证或者是相关药理作用进行本系统内的靶点筛选。例如，调血脂药不能仅仅是筛选低密度脂蛋白受体（Low Density Lipoprotein Receptor，LDLR），同时还要对调血脂相关的靶点进行筛选，在此基础上再进行作用机制相关靶点的研究和因果关系确证。对于具有调血脂作用的中药小分子进行机制研究，仅仅确定所指向性指标是不够的，还需要对于一般公认的与脂代谢相关的因子进行表达观察，才能清楚说明其指向性指标的专属性。例如，枯草溶菌素转化酶9 （Proprotein convertase subtilisin kexin，PCSK9）是近年来发现的具有调脂作用的重要因子[16-18]，要说明受试药物的作用靶点是PCSK9，不能只观察该因子，还需要观察LPL，LDLR，HMGCoA等没有明显作用后，才能说明PCSK9指标的专属性，而事实上往往是受试药对所测指标均有作用。又比如，研究一种抗脑出血药，除了对相关脑出血动物模型进行药效学观察外，其凝血系统是必不可少的观测指标。

在进行作用靶点研究时，以下5点须考虑：①筛选出相关靶点。②利用生物技术进行靶点特异性确认，即因果关系，可以用化学小分子抑制剂，再用相关基因缺失或蛋白缺失的方法，主要是定点基因突变或者是定点氨基酸突变；也可以从过表达方面反向证明。③研究层次上，先以细胞、酵母等体外实验为主。再在整体动物实验从整体水平确认，常用的是转基因或基因敲除小鼠。如果所观察的靶点较明确，也可以用线虫进行。④进一步确定药物作用是在转录水平，还是翻译水平；是在基因表达还是蛋白水平。⑤在涉及信号通路上，须探讨受试药物对该通路作用点的确切性。即回答是同时作用于该通路上的各个靶点，还是作用于通路的起始靶点（图2）。

图2 药物作用靶点的确定

我们在研究小檗碱（Berberine，BBR）作用机制方面发现BBR可以分别作用于基因转录启动区的TATAbox和mRNA尾端的polyA，这两个位点分别影响了基因的转录和蛋白的表达。为了证明这种作用靶点的特异性，即确定因果关系，我们选择了两个因子HSP70和Rb1。前者转录启动区含有TATAbox，而后者不含TATAbox。BBR表现出对HSP70转录抑制，而对Rb1没有抑制作用，这表明了BBR可能作用于转录区的TATAbox。为了证明这种作用的特异性，我们将这两个因子的转录启动区进行交换，HSP70转录启动区换为Rb1的启动区序列后，BBR对HSP70的转录抑制作用消失了；Rb1更换为HSP70的转录启动区序列后，BBR则表现出了转录抑制的效应。进一步，我们将转录区的TATAbox序列“TATAAA”进行定点突变为“GGGCGG”，则BBR对HSP70转录抑制作用消失。而将Rb1转录区的“GGGCGG”序列定点突变为“TATAAA”，则BBR由原来的无明显作用转而表现出抑制基因表达的效应。由此层层递进地证明了BBR不仅作用于含TATAbox的转录启动区，而且就是“TATAAA”核酸序列[19-21]。

5 小结

中药小分子以其来源于天然，而常常表现为靶点的多样性。因此，表象药理是常用的观察方法。但是这种表象指标只能说明其相关性，而不能说明其因果关系。所以，这种方法所获得的信息以及所得的结果，尚不能简单称其为“机制”。这是目前中药研究中最常出现的问题。要真正意义阐明其机制，尚需要运用分子生物技术对其进行因果关系确证后的结论才能称之为“作用机制”。即对于表象药理方法所获得的结果，在下结论时需要谨慎。

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Natural Small Molecules and Their Phenotype Pharmacology and Mechanisms of Drug-Action

Lei Fan1,2, Xing Dongming1, Yan Xiaojin1, Du Lijun1
(1. Laboratory of Molecular Pharmacology and Pharmaceutical Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China; 2. School of Pharmacology and Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

This report discussed internal characteristics and its related pharmacological researches in natural small molecules (traditional medicines), by comparing with similarities and differences in their concepts, phenotype pharmacological characteristics, specific targets and action mechanisms between natural small molecules and synthetic compounds. Natural small molecules often represented three specific features: unexpected discovery, internal target diversity and multiple mechanisms of action. Therefore, in the pharmacological study of natural small molecules, related targets screening must be performed to determine the correlations of the targets and mechanisms, and finally to identify their specificity. In this report, a systematic in-depth discussion on natural small molecures was pressed ahead with for better understanding and to grasp the correlations and the specificity of natural small molecular actions, which may promote the new-drug discovery and development from natural small molecules (traditional Chinese medicines).

Natural medicines, small molecule, phenotype pharmacology, new-drug research and development

10.11842/wst.2016.06.011

R96

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-05-24

修回日期：2016-06-13

＊ 国家自然科学基金委青年基金项目（30801523）：石榴叶总酚成分对脑缺血过程中PPARγ转录活性的影响及其脑保护作用研究，负责人：雷帆；国家自然科学基金委面上项目（81374006）：基于小檗碱作为DNA插入子探讨其对正常与缺血再灌神经元基因转录作用差异的机制，负责人：邢东明；国家自然科学基金委面上项目（81073092）：从G0/G1期启动探讨小檗碱及黄连对缺血再灌损伤神经元保护作用的位点，负责人：杜力军。

＊＊ 通讯作者：杜力军，本刊编委，教授，主要研究方向：药理学。