海洋无脊椎动物补体系统研究进展

彭茂潇，牛东红，李家乐

（上海海洋大学水产与生命学院，农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306）

·综述·

海洋无脊椎动物补体系统研究进展

彭茂潇，牛东红，李家乐

（上海海洋大学水产与生命学院，农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306）

补体系统是先天免疫的重要组成部分，在免疫反应中发挥重要作用。补体的研究可以为海洋无脊椎动物提供病害防治的理论基础。本文介绍了海洋无脊椎动物补体系统中已报道的C1q、MBL、ficolin、MASP、B因子、C3和C6等成分，比较了海洋无脊椎动物补体成分的功能，描述了其补体激活途径和补体系统进化情况。目前，海洋无脊椎动物补体的研究发展很快，揭示可能存在与脊椎动物差异较大的补体系统，但是缺乏系统的基础研究而未能构建起理论模型。

海洋无脊椎动物；补体系统；补体途径；系统进化

补体系统是由一系列40多种蛋白质分子所组成、有着精密调控机制的蛋白质反应系统。补体作为众多免疫效应机制中的一员，在免疫过程的末端和吞噬作用以及炎症反应等一起发挥着作用。补体的研究始于19世纪中叶BUCHNER等［1］对体外血清热敏性物质杀灭细菌的研究，然而“补体”一词由PUAL于1899年提出的时候就被认为是一批并不严格相互依赖的因子［2］。补体一直被认为是免疫应答机制中的配角。21世纪，补体分子与重大疾病关系的功能研究频频被报道，学者们开始重视补体这一被低估的分子类群。

无脊椎动物缺乏真正的抗体和特异性的免疫细胞，机体防御反应依靠非特异性的先天免疫［3］。补体在体液免疫中发挥着重要作用，是连接先天免疫和适应性免疫的枢纽［4］。在昆虫和线虫等陆生原口类无脊椎动物中大部分的补体成分没有被发现，无脊椎动物补体的研究绝大多数以海洋无脊椎动物为对象［5］，主要集中在脊索动物、节肢动物、棘皮动物、刺胞动物和软体动物。近年来，补体作为先天免疫的重要组成部分，以及与抗体多个水平上发生相互作用的特殊角色，其在海洋无脊椎动物病害防治和免疫机制的研究中不断被重视。海洋无脊椎动物补体的研究起步较晚，多处于相关成分基因的克隆、蛋白质结构的分析、单一成分功能的描述、途径的初步探索和进化演变分析。

1 海洋无脊椎动物补体成分分析

基于参与途径的不同，补体成分在哺乳动物中可以分成4类：1）固有成分：主要包括C1复合体（C1q、C1r和C1s）、C2～C9、B因子、D因子、P因子、甘露糖结合型凝集素（MBL）、ficolin和甘露糖结合型凝集素关联丝氨酸蛋白酶（MASP）；2）调控分子：主要包括C1抑制物、I因子、H因子、C4结合蛋白和膜辅助蛋白等；3）补体受体：主要包括CR1～CR5、C1q受体、C2a/C4a受体、H因子受体和不同片段的C3和C5受体等；4）活性片段：主要包括C3a、C4a和C5a等以及这些活性片段的进一步分解产物［2，6］。

海洋无脊椎动物补体成分比脊椎动物要少，就某一单一成分来说存在不同程度的亚型，往往亚型数量众多［7］，甚至在不同的个体发育时期也存在不同亚型的差异表达［8］。海洋无脊椎动物补体成分的研究主要以补体固有成分为主，其它成分仅个别被报道。从固有成分所形成的分子家族角度来看，在海洋无脊椎动物中，C1q家族（C1q、MBL和ficolin）分子均有所发现，MASP家族（MASP、C1r、C1s）中仅MASP分子被发现，B因子家族（B因子和C2）中仅B因子被发现，C3家族（C3、C4和C5）中仅C3被发现，补体终末成分家族（C6、C7、C8和C9）中仅C6被发现。

1.1 C1q

C1q蛋白分子在文昌鱼（Branchiostoma belcheri）［9］、玻璃海鞘（Ciona intestinalis）［10］、紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）［11］、霸王莲花青螺（Lottia gigantean）［12］、海蠕虫（Capitella teleta）［12］、佛罗里达海牛（Trichechus manatus latirostris）［13］、栉孔扇贝（Chlamys farreri）［14］、海湾扇贝（Argopecten irradias）［15］、紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）［16］、文蛤（Meretrix meretrix）［17］、近江牡蛎（Crassostrea ariakensis）［18］和堡礁海绵（Amphimedon queenslandica）［19］等海洋无脊椎动物中被报道。研究发现作为补体经典途径的启动分子Clq，在海洋无脊椎动物中存在大量的含有Clq结构域的ClqDC分子［20］。在长牡蛎（Crassostrea gigas）中发现了321个亚型［21］。

在哺乳动物中Clq分子是由6个亚单位组成的异源六聚体，各单位N端为聚成束状的胶原区，C端为放射状球形的Clq结构域，依其分子结构被分为ClqA、ClqB和ClqC三个亚家族。对海洋无脊椎动物C1q结构分析表明这些ClqDC分子均不属于哺乳动物的ClqA、ClqB和ClqC亚家族，但是存在C1q分子的特征结构域［22］。

1.2 M BL和ficolin

海洋无脊椎动物中MBL蛋白分子在文昌鱼［23］和玻璃海鞘［24］中被发现并存在数量较多的亚型。ficolin蛋白分子在文昌鱼［25］、真海鞘（Halocynthia roretai）［26］、玻璃海鞘［24］、紫海胆［11］、长牡蛎［27］和堡礁海绵［19］等海洋无脊椎动物中都有发现，与MBL不同的是亚型数量有所减少。

MBL和ficolin分子的结构和Clq相似，N端均为聚成束状的胶原区，仅在C端的放射状球形结构域上各自有所差别。在海洋无脊椎动物中除MBL分子外，真海鞘中还发现了MBL类似分子——葡萄糖结合型凝集素（GBL），GBL的C端与MBL类似，存在一个C型凝集素的CRD；而N端与MBL不同，不存在胶原蛋白区域，而含有一段α螺旋［28］。此外，在玻璃海鞘中还存在其它MBL或ficolin的类似物，如ficolin的类似分子AsFCN［26］和MBL-like分子［29］。近期的研究发现，海洋无脊椎动物中含有大量的C型凝集素（含有甘露糖结合型CTLD结构），以及含纤维蛋白原样结构域（FBG）的纤维蛋白原相关蛋白（FREPs），但是在结构上大都缺少MBL或ficolin分子N端的胶原蛋白区域，少数存在类似海鞘GBL的α螺旋区域［30］。

1.3 MASP

海洋无脊椎动物中仅文昌鱼报道了MASP1和MASP3分子［23］，以及真海鞘［31］和海葵［32］中报道了MASP1分子。除此之外，在其它海洋无脊椎动物中目前未有该家族分子的报道。MASP分子C端拥有丝氨酸结构域，其它结构域主要包括补体控制蛋白（CCP）和胰岛素样丝氨酸蛋白酶（Tryp＿SPc）。与脊椎动物相比该家族基因同源性较低，除存在特征性的丝氨酸蛋白酶结构域组合外，在海洋无脊椎动物中其特征结构域的拷贝数存在差异。

1.4 B因子

B因子在文昌鱼［33］、玻璃海鞘［34］、紫海胆［35］、圆尾鲎（Carcinoscorpius rotundicauda）［36］和欧洲沟纹蛤仔（Ruditapes decussatus）［37］等海洋无脊椎动物中被报道，并且存在一定数量的亚型。

B因子结构与MASP分子相似，均为含丝氨酸结构域分子，主要包括相同短序列重复（SCR）、A型血管性血友病因子（VWA）和丝氨酸蛋白结构域。与脊椎动物相比，在海洋无脊椎动物中B因子的分子结构同源性较高，但是仍然具有差异。海鞘的B因子在N端另外具有2个A类低浓度脂蛋白受体（LDLR）结构域和1个CCP结构域，中国鲎（Tachyplens tridentatus）B因子在N端另外具有2个CCP结构域［38］，其它海洋无脊椎动物B因子的N端均有不同程度结构域的增加。

1.5 C3

C3是补体系统的中心成分，已在文昌鱼［39］、真海鞘［40］、玻璃海鞘［10］、日本刺参（Apostichopus japonicus）［41］、纵条矶海葵（Haliplanella lineate）［42］、圆尾鲎［36］、刺柳珊蝴（Swiftia exserta）［43］、堡礁海绵［19］、欧洲沟纹蛤仔［37］、霸王莲花青螺［12］、紫海胆［35］、长牡蛎［27］和夏威夷短尾鱿鱼（Euprymna scolopes）［44］等海洋无脊椎动物中被报道。C3分子与大部分补体分子一样在海洋无脊椎动物中存在多种亚型。

C3是一种β2糖蛋白，由α和β两条肽链组成，属于硫酯蛋白（TEP）超家族。这类分子在结构上都含有高度保守的α2巨球蛋白结合蛋白酶区域的一个硫酯键位点（thioester site）［45］。在已发现的海洋无脊椎动物C3分子的研究表明，其结构与脊椎动物高度同源。

1.6 C6

C6蛋白分子作为一种典型的嵌合糖蛋白是补体终末成分（TCC）家族的一员。在海洋无脊椎动物中，该家族成分仅C6分子被发现于文昌鱼［46］。研究发现除文昌鱼外的海洋无脊椎动物虽然缺乏TCC家族的分子，但是复合膜攻击穿孔蛋白（MACPF）结构域作为该家族的共有保守结构域在大部分海洋无脊椎动物中被证明存在［5］。

2 海洋无脊椎动物补体成分功能的研究

海洋无脊椎动物补体成分的功能研究尚处于个体物种零星报道的初步阶段。最新研究表明，在海洋无脊椎动物中补体系统各成分存在多种亚型的同时，各单一成分亚型之间功能上可能存在差异。

2.1 C1q

C1q是激活补体经典途径的模式识别受体分子，由于普遍认为海洋无脊椎动物缺乏抗体，其C1q的功能一直未被系统的描述。研究发现文昌鱼AmphiC1q1分子能被LPS和细菌刺激上调，而且具有抑制血小板凝集等高等脊椎动物Clq分子的特性［47］。在软体动物栉孔扇贝和海湾扇贝的C1q研究中发现这些分子可以被微生物或LPS刺激而上调，并且具有凝菌活性，该活性可以被D-甘露糖和肽聚糖所抑制［22］。同时WANG等［14］发现栉孔扇贝的C1q分子能识别高等动物IgG抗体并与之结合，类似的结果在文蛤［17］和斑节对虾（Penaeusmonodon）［48］中也有所体现。

2.2 MBL和ficolin

在海洋无脊椎动物中对MBL和ficolin两个分子的功能研究发现，其功能与哺乳动物的MBL分子功能类似。海鞘的GBL分子也能与海鞘的MASP结合激活凝集素途径［28］，在栉孔扇贝CfLec-1的研究中发现其还具有调理的作用［49］。在文昌鱼中发现的一个ficolin同源分子BjFCN1被证明参与了补体凝集素途径［25］。同时，含CTLD结构的C型凝集素和含有FBG结构的FREP在海洋无脊椎动物中均参与了免疫反应。在海湾扇贝C型凝集素AiCTL-9的研究确认其在Ca2＋存在的情况下能对特定的菌种产生凝集反应［50］，而在栉孔扇贝CfFREP的研究中未发现其凝菌活性［51］。

2.3 MASP

对海鞘的MASP功能研究认为，其功能上与脊椎动物MASP分子存在高度保守性，均结合MBL或ficolin分子发挥作用［31］。

2.4 B因子

海洋无脊椎动物中B因子的功能研究集中在旁路途径的功能验证上，在一定程度上证明了B因子在功能上的保守性。此外，在鲎中发现B因子可以和C3结合形成复合物，在Mg2＋存在下，使C3结合到革兰氏阳性菌或酵母表面［38］，说明在海洋无脊椎动物中B因子还具有脊椎动物凝集途径的相关功能。

2.5 C3

在海洋无脊椎动物中C3分子功能的研究表明其具有类似于脊椎动物C3的补体功能、调理作用和吞噬作用［52］，PINTO等［53］研究了海鞘的C3a的活性片段，发现其能介导炎症作用，在功能上与脊椎动物存在高度保守。HIBINO等［8］在玻璃海鞘中对C3三个亚型（CiC3-1、CiC3-2和CiC3-3）进行研究发现，CiC3-1和CiC3-2在成体中表达，CiC3-3只在幼体中表达，并认为CiC3-3可能不参与补体途径而与幼体的生长发育有关。这也验证了在海洋无脊椎动物中部分补体家族成分未分离多亚型的存在，可能分担不同的功能，较脊椎动物相比甚至更多的观点。

3 海洋无脊椎动物补体激活途径的研究

海洋无脊椎动物补体激活途径的研究目前处于初步分析和假说阶段。近年来，无脊椎动物的补体激活途径在一些代表物种上逐步开始了相应的研究。由于脊索动物存在真正意义上的MASP基因，NONAKA等［54］研究了海鞘的补体激活途径后认为其存在凝集素激活途径。当然目前未能解释海葵中MASP基因与凝集素激活途径的关系。研究认为C3分子和B因子普遍存在于海洋无脊椎动物中，因此旁路途径全面存在于海洋无脊椎动物中，但是不存在经典途径［55］。然而，目前均缺乏这两个途径在海洋无脊椎动物中存在的系统性实验证据，未能解释C1q在海洋无脊椎动物中普遍存在的原因。个别海洋无脊椎动物C1q功能的研究预示着其可能参与凝集素激活途径，但是缺乏系统证据。在海洋无脊椎动物中针对终末途径的研究有过初步的探索。THAI等［56］研究认为，由于在文昌鱼中缺乏FIM结构域负责调控的C345C结构域的C5分子，所以其发现的C6成分不具有脊椎动物终末途径的活性，并认为在海洋无脊椎动物中不存在终末途径。另外，针对海鞘分泌的毒液研究发现，其中含有大量的MACPF结构域的非TCC分子蛋白并且有很高的溶血功能，认为其中可能存在原始的类似终末途径［5］。

此外，TAGAWA等［38］研究报道了一个有B因子参与的中国鲎的补体激活途径，研究发现中国鲎中TtCRP-1、TL-5A、TL-1和TPL-1分子可以召集C3和B因子的复合物到革兰氏阳性菌和酵母表面形成C3转化酶，进而催化更多的C3分子结合到这些微生物表面，同时还发现一个未知的C因子参与其中，表明其不同于脊椎动物的补体激活途径的存在可能。这可能预示着海洋无脊椎动物具有更多特有的补体激活途径，并且涉及范围和角色也有所不同。基于海洋无脊椎动物补体成分和功能的研究现状，其补体激活途径和机制是研究的热点。

4 海洋无脊椎动物中的补体系统进化研究

补体系统中的大多数成分有着特征性的结构域及其组合形式，可以利用基因的结构分析研究补体系统的起源与进化。C3是被认为最早出现的补体分子，其在无脊椎动物中的结构被证实和高等动物C3分子高度同源［52］。研究同时发现多孔动物中存在部分补体成分丢失现象。在海绵中不存在C3分子但是存在其旁系同源TEP分子，又鉴于TEP分子从细菌开始广泛的分布于生物中，针对这种现象CERENIUS等［57］认为从刺胞动物开始由于过敏毒素（ANATO）等结构域的插入才出现真正意义上的C3分子。

成分上的进化容易被描述，然而途径角度的进化则较模糊而不容易被描述。研究发现，海鞘的凝集素激活途径与脊椎动物的凝集素激活途径相似，存在明显的进化痕迹但未知其途径机制［54］，类似的研究结果在紫贻贝中得到了验证［58］。在海葵中发现MASP的证据也预示了脊椎动物的凝集素途径可能演变于原始的低等海洋无脊椎动物中。在鲎的未知补体C因子的途径研究表明，海洋无脊椎动物的旁路途径与脊椎动物的途径相比，既存在进化痕迹又存在较大的差异，同样未知其途径机制［59］。目前对终末途径和经典途径进化演变的研究认为它们均起源于有颌类脊椎动物，并预测海洋无脊椎动物的终末途径可能是仅由部分成分结构域参与组成的新途径［5］。

由于缺少大量的基础研究，整体上海洋无脊椎动物补体系统进化演变的研究缺乏系统的实验证据。NONAKA［55］提出了补体系统进化的观点，认为在I因子依赖的调节机制出现之前的无脊椎动物中存在原始的补体系统，随着I因子在低等脊椎动物中的产生进而出现了中级系统，最后在大规模基因复制事件［60］发生后在脊椎动物中出现了完善的补体系统（图1）。HIBINO等［8］的研究也证实了这一观点。

图1 补体系统的进化［55］Fig.1 Evolution of com p lem ent system

5 结语

综上所述，补体系统在海洋无脊椎动物中的研究尚处于初级阶段，研究主要集中在补体系统的固有成分，而且较脊椎动物而言补体成分不全，存在单一成分多亚型的现象。另外，补体受体成分和补体结合蛋白在海洋无脊椎动物中的研究报道较少，仅有真海鞘中与CR3受体分子功能相似的整合素α和β亚单位分子［61－62］、玻璃海鞘中 C3aR受体分子［63］以及斑节对虾中C1qBP的研究［48］。在脊椎动物中补体活性片段成分的研究常常伴随深入的功能研究，在海洋无脊椎动物中这方面的研究较缺乏，仅见于海鞘C3裂解片段的报道。海洋无脊椎动物补体成分的功能研究基本处于与高等脊椎动物补体成分功能的模拟验证阶段，未深入研究其在生命过程中的作用及其自身特有的途径。但是，随着越来越多的动物全基因组测序的完成，以及高通量测序技术的大规模应用，海洋无脊椎动物中补体成分基因将逐渐被发现，随之补体在海洋无脊椎动物中的功能和途径研究也将更加完善，为我们解决养殖病害、生长抗逆问题提供了可观的前景。

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Complement system in marine invertebrate

PENG Mao-xiao，NIU Dong-hong，LIJia-le
（Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Shanghai Ocean University，Ministry of Education，Shanghai201306，China）

The complement system is an important part of innate immunity and plays a vital role in immune responses.This study can provide theoretical basis for disease control of the economic farming of marine invertebrates.This article described the ingredients including C1q，MBL，ficolin，MASP，B factor，C3，and C6 etc.，which had been found in the complement system ofmarine invertebrates.The inherent component of the complement system in marine invertebrates is a major study subject requiring deep research.Though our understanding of complement receptor，active fragment and binding protein is growing，it is still limited in mammalian vertebrates.The complement component of marine invertebrates is less than that in the vertebrates，there are different subtypes in terms of the amount in a single component，in most case，the number of subtypes is large.Different individuals vary greatly in the complement components and they have different expression in differet periods of developmental stage.We compared the function of complement component in marine invertebrate，finding that each complement component was presented in a variety of subtypes and there were differences between the functions of various subtypes.We also described some of the primary actors and pathways of the complement system inmarine invertebrates.Lectin pathway and alternative pathway potentially existed in marine invertebrates，but the classic pathway and terminal pathway were not found yet.After comparison of the vertebrate and invertebrate complement pathway，we found thatmarine invertebratesmay have their special features in terms of these pathways.The research on complement pathway in marine invertebrates is relatively limited.No systematic theoretical model has been developed to fully display the development ofmarine invertebrate complement pathway.This article also described the evolution ofmarine invertebrate complement system and compared with vertebrate the invertebrate features of evolution of complement component obviously.In the pathway there was not only the trace of evolution but also the existence of significant differences.At present，the state of research of complement system in invertebrates is primary.The development ofmarine invertebrates complement is fast，but short of basic research，failing to establish a large-scale system of theoreticalmodels.With more finished full sequence of gene from different species，and the use of technology of height sequence in study，gradually，complement gene will be found，and the function and pathway will be improved in marine invertebrates.The exploratory study of complement system in marine invertebrate will offer a critical framework for better understanding of immune system and stress resistance in the growth ofmarine invertebrates.

marine invertebrate；complement system；complement pathway；evolution

S 917

A

1004－2490（2016）03－0320－09

2015－07－03

国家“863”高技术研究发展计划（2012AA10A400）；国家自然科学基金（31472278）；上海知识服务平台（ZF1206）

彭茂潇（1991－），男，浙江温州人，硕士研究生，研究方向为水产动物遗传育种。E-mail：maoxiaoccc＠qq.com

李家乐，教授，博士生导师。E-mail：jlli＠shou.edu.cn