斑马鱼报警反应产生发育阶段的研究

曹小龙，祖 尧，张庆华，贾 亮，李伟明

（上海海洋大学水产种质与资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306）

斑马鱼报警反应产生发育阶段的研究

曹小龙，祖 尧，张庆华，贾 亮，李伟明

（上海海洋大学水产种质与资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306）

鱼类在遭受捕食后，受损的表皮会释放大量的化学信号物质，同种其它个体嗅到这些化学信号后会作出躲避反应，称为报警反应（alarm response），报警反应通常出现在一定的发育阶段。采用斑马鱼（Dinio rerio）同种碾碎提取物（处理组，质量浓度为10－6g·L－1）作为报警物质，并设3个对照组：罗非鱼碾碎提取物组、双蒸水组、空白对照组，通过暴露处理实验，检测沉底累积时间（time of bottom）、呆滞累积时间（time of freezing）两项指标，研究了28 dpf（days post fertilization，受精后天数）、35 dpf、42 dpf 3个不同发育时期幼鱼的报警反应。结果显示：28 dpf时，处理组与3个对照组相比，在沉底累积时间、呆滞累积时间两项指标上均无显著差异，这个时期处理组有2 ind斑马鱼出现“沉底”，其中1 ind出现“呆滞”；35 dpf时，处理组与3个对照组相比，在沉底累积时间上有显著差异（P＜0.05），在呆滞累积时间上无显著差异，这个时期有5 ind斑马鱼出现“沉底”，其中1 ind出现“呆滞”；42 dpf时，处理组与对照组相比，在沉底累积时间、呆滞累积时间两项指标均有显著差异（P＜0.05），这个时期有8 ind斑马鱼出现“沉底”，且8 ind全部出现“呆滞”，与此对应的是这个时期大部分个体出现明显的报警反应。研究表明，斑马鱼报警反应产生的发育阶段为35～42 dfp之间，结合已知的野外斑马鱼生活史，推测斑马鱼在特定的阶段产生报警反应可能与栖息地的迁移有关。

斑马鱼；报警反应；发育；栖息地

动物界中，当个体受到捕食者袭击时，会主动或被动地向同种其它个体发出报警信号，以躲避潜在的危险［1－5］。生活在水环境中的鱼类，当个体受伤时，破损的表皮会向周围的环境中释放化学信号物质，引发同种其它个体的反捕食行为［6－8］，称为报警反应（alarm response），引起报警反应的化学信号物质称为报警物质（alarm substance）。1938年，VON FRISCH［9］最早在真鱥（Phoxinus phoxinus）中观察到了鱼类的报警反应，并对此做了详尽的描述，由此开启了鱼类报警行为研究的先河［9－11］。半个多世纪以来，鱼类的报警反应研究取得了长足的发展，涉及到的相关领域包括行为学、神经生物学、心理学、生物化学等。然而，关于鱼类报警反应产生的时期却鲜有报道。

生命个体在生活史的早期阶段，自我保护能力较弱，容易受到捕食者的袭击，因此从自然选择压力来讲，报警反应应该越早出现越好。然而，令人困惑的是，事实并非如此。已有研究表明，鱼类只有到了特定的发育阶段才出现报警反应。例如，真鱥在受精后50 d左右才出现报警反应［11］；斑马鱼（Danio rerio）可能在孵化后32～52 d才出现报警反应［12－13］。这些研究初步界定了报警反应出现的时间，然而，并没有针对报警反应出现的特定行为（包括沉底、快速游动、呆滞等）进行定量分析。此外，前期研究中，实验用的斑马鱼饲养条件各异，缺乏统一的标准。近年来，斑马鱼作为模式动物在行为神经科学及行为遗传学领域得到广泛应用，另外斑马鱼高度集中化养殖体系得到了进一步发展，形成了相对统一的规范和标准。在这样的背景下，有必要进行特征性行为的定量分析从而对斑马鱼报警反应产生时间做进一步的研究。本文通过报警物质暴露处理实验，比较检测了28 dpf（days post fertilization，受精后天数）、35 dpf、42 dpf 3个不同时期的斑马鱼幼鱼的沉底累积时间、呆滞累积时间两项报警反应指标，界定了在目前实验室养殖条件下的报警反应出现时间，以期为该研究领域提供基础资料，并为进一步深入研究报警反应的机制提供有效模式。

1 材料与方法

1.1 实验动物

AB品系的野生型斑马鱼购自国家斑马鱼模式动物中心（中国上海），在本实验循环养殖系统中传代驯化。孵化斑马鱼出膜后转移到3 L鱼缸中，每天早晚2次（9∶00，18∶00）喂食草履虫（Paramecium），3周后，将幼鱼转移到循环系统中喂养，鱼缸容积3 L，实验鱼总计40 ind，每天2次（9∶00，18∶00）喂食初孵卤虫（Artemia salina）。实验室内养殖标准：光照条件为L∶D＝14 h∶10 h；养殖用水由自来水经系统自带的净化设备处理后进入养殖系统，水温（27±1）℃，盐度4，pH值为7.0±0.5，24 h曝气。实验前24 h及实验过程中停止喂食。

1.2 报警物质制备

本实验中，报警物质制备参考WALDMAN的制备方法［13］，采取整鱼碾碎，具体流程如下：取2 ind健康斑马鱼（♀♂各1 ind），置于冰上麻醉，随后将其转移至2 mL离心管。用全自动组织匀浆机（MP Biomedicals，Fastprep－24）将斑马鱼均匀打碎30 s，以浆液均匀无颗粒为准。高速离心机（Eppendorf，5424R）4℃、12 000 r·s－1离心10 min，取上清液，按1 g体质量稀释至1 L的标准稀释，以此作为原液。实验前制备新鲜报警物质，实验过程中，将离心管置于冰盒中，可以有效减少报警物质效力的损失。同样取2 ind健康罗非鱼（Oreochromisspp.）（与斑马鱼等重）作为异种对照，按上述流程制备报警物质。

1.3 暴露实验

前期实验发现：30 dpf时，斑马鱼无报警反应出现；40 dpf时，普遍出现报警反应，因此将报警反应出现的时间初步界定在30～40 dpf之间。

正式实验：实验共检测28 dpf、35 dpf、42 dpf 3个发育时期的斑马鱼（来源于同一亲本），每个时期均设同种碾碎物提取物处理组，即Conspecific组和3个对照组：Heterospecific组（罗非鱼碾碎提取物）、Water组（双蒸水）、Blank组（空白对照），共计4组，每组10 ind斑马鱼。报警物质暴露处理时将原液按1∶1 000加入检测缸。

检测缸长12 cm、宽4 cm、高8 cm（28～42 dpf的幼鱼个体小且游泳速率较慢，因此采用该规格小缸进行检测）。报警物质暴露处理时，采取单尾检测（每个检测缸中1 ind斑马鱼）。

实验前将待检测斑马鱼转移至检测缸，适应20 min。实验中采用摄像机（SONY，HDRPJ390）拍摄视频记录：Water组、Heterospecific组及Conspecific组在报警物质暴露处理后拍摄3 min，同时对Blank组拍摄3 min。

1.4 运动轨迹分析

斑马鱼的报警反应是一个较为复杂的行为过程，其中沉底和呆滞行为是报警反应的2个典型特征，本实验采用SPEEDIE等［14］的行为定量方法，用以下两项指标来表征斑马鱼报警行为响应：（1）缸底累积时间（time of bottom）；（2）呆滞累积时间（time of freezing）。以水面高度为准，将鱼缸垂直方向分为顶部、中部、底部3部分（等分），其中底部视为缸底。呆滞界定为：鱼体静止不动，只有眼动和鳃动。用小型动物行为活动轨迹记录分析系统Ethovision XT 10.1（Noldus，Wageningen，The Netherlands）进行视频信息采集，得到相应指标的数据。

1.5 数据统计分析

以上采集到的运动轨迹数据，采用SAS 8.1统计分析软件，在0.05的置信水平对两项指标进行单因素方差分析，用Duncan法检验。文章中所有图形均使用Graphpad 5.0软件绘制，实验结果用平均值±标准误的形式表示。

2 结果与分析

在28 dpf，Conspecific组与其余3组之间在缸底累积时间和呆滞累积时间两项指标上，均无显著性差异（图1），这个时期有2 ind斑马鱼出现“沉底”，其中1 ind出现“呆滞”（图2）；在35 dpf，Conspecific组与其余3组之间在沉底累积时间上，有显著性差异（P＜0.05）（图3），这个时期有5 ind斑马鱼出现“沉底”，其中1 ind出现“呆滞”（图4）；在42 dpf，Conspecific组与其余3组之间在缸底累积时间、呆滞累积时间上，均有显著性差异（P＜0.05）（图5），这个时期有8 ind斑马鱼出现“沉底”，且8 ind全部出现“呆滞”（图6）。

图1 受精后28 d实验斑马鱼的行为反应Fig.1 Behavioral response of 28 dpf Danio rerio

图2 受精后28 d实验斑马鱼（热区图）Fig.2 28 dpf Danio rerio（Heatmap）

图3 受精后35 d实验斑马鱼的行为反应Fig.3 Behavioral response of 35 dp f Danio rerio

图4 受精后35 d实验斑马鱼（热区图）Fig.4 35 dpf Danio rerio（Heatmap）

图5 受精后42 d实验斑马鱼的行为反应Fig.5 Behavioral response of 42 dpf Danio rerio

图6 受精后42 d实验斑马鱼（热区图）Fig.6 42 dpf Danio rerio（Heatmap）

3 讨论

从结果分析来看，随着发育时期的推移，Conspecific组中出现“沉底”和“呆滞”的个体数量呈现出递增趋势，即表明出现报警反应的个体数量增加；而对照组则没有明显变化。通常对于一个典型的报警反应可以作如下描述：受试个体出现报警反应，首先表现为快速潜入缸底，随后在缸底沿着水平方向进行快速的往复游动，这个过程通常会持续十几秒到几十秒不等，常见的在15～30 s之间，之后一些个体会进入“呆滞”状态，这个过程持续数秒到数分钟不等，少数个体甚至持续数小时。而未进入“呆滞”状态的个体则在随后的数分钟内逐渐恢复常态。值得注意的是，在35 dpf时，Conspecific组与3个对照组相比在“沉底累积时间”上有显著性差异（P＜0.05），而在“呆滞累积时间”这项指标上没有显著性差异，5 ind出现“沉底”的个体中，仅有1 ind出现“呆滞”。推测在报警反应过程中“沉底”可能是必然的过程，而“呆滞”则是可能发生的情况。长期以来报警反应被认为是一种恐惧反应，笔者认为“沉底”发生在报警反应的开始阶段，是一种本能的避险行为，而“呆滞”则可能是一种重度恐惧的结果。在42 dpf时，Conspecific组中8 ind出现“沉底”的个体，全部出现“呆滞”状态，与42 dpf的个体相比，35 dpf的个体沉底后更易恢复常态。

鱼类的报警反应是先天性行为，并非后天习得［15－16］。本研究发现，受精后35～42 d的斑马鱼，在首次接受报警物质（成鱼提取物）处理时即表现出报警反应，包括沉底、快速游动、呆滞等。在对其它鱼类的研究中，也有类似现象，即报警行为均出现在一个特定的发育阶段。例如，真鱥在受精后50 d开始出现报警反应［11］。在早期研究中，一些学者在斑马鱼中也做过类似实验，如PFEIFFER［12］发现在喂食的同时给予报警物质刺激会导致孵化后32 d的斑马鱼逃避摄食区域；WALDMAN［13］发现在对孵化后48～52 d的斑马鱼给予成鱼报警物质刺激后，会导致受试群体在检测缸中的运动分布整体下移。这些研究显示32～52 d的斑马鱼可能已经出现报警反应。然而，以往的研究主要是对行为特征的描述，并没有针对报警反应出现的特定行为（包括沉底、快速游动、呆滞等）进行定量分析。此外，在早期的这些研究中，实验用的斑马鱼饲养条件各异，缺乏统一的标准，如WALDMAN［13］的研究中，实验斑马鱼每天仅喂食一次，导致斑马鱼发育延迟，这可能是导致报警反应出现时间较晚的原因，表明报警反应可能跟发育有关。

斑马鱼报警反应出现在特定的发育阶段，推测原因可能有2种：一种可能是，到了一定的发育阶段，幼鱼行使复杂行为的能力才得到充分发展和完善；然而，MCHENEY等［17］的研究表明，受精后5 d的斑马鱼已经能够根据水流波动判断捕食者的存在，并作出逃避反应；此外，实验过程中，笔者发现20 dpf的斑马鱼当移动鱼缸时即可表现出类似报警反应的行为模式。由此说明，可能受精后20 d的斑马鱼实际上已经具备行使复杂行为的能力。因而，这第一种假设应被排除。另一种可能是，到了一定的发育阶段，识别报警物质的嗅觉受体才表达，亦或是相关的神经通路才发展形成。已有研究在一定程度上支持了这一假设，LINDSAY等［18］发现，受精后3 d的斑马鱼幼鱼在给予氨基酸气味刺激后即表现出游泳活动增加；对报警物质或一些繁殖相关的信息素的反应则出现在较迟的发育阶段［13，19］。刚孵化的斑马鱼嗅球中神经元的数量只占成年个体的5%，在此后的数周，数量逐渐增多［20］，显示嗅觉系统的发展是一个逐步完善的过程，而这一过程历经数周，同时可能伴随着嗅觉功能的发展和完善。这一点与本研究结果基本吻合。此外，已知的野外调查记录显示：在野生条件，斑马鱼栖息地，成年斑马鱼通常出现在植被覆盖的浅滩区域，或者是溪流中有悬垂植被遮蔽的区域。在溪流中，成年斑马鱼不得不遭遇它们的捕食者，如一些鳢属（Channa）的鱼类。幼鱼和小鱼很少在溪流中出现，它们一般生活在浅滩，这些浅滩区域水流缓慢，或者形成凹形死角，但与溪流相通。在这些区域，没有大型的捕食者出现［21－23］。一个可能的斑马鱼野外生活史：成年斑马鱼主要在溪流生存，雨季洪涝时节（每年4～8月，也是野生斑马鱼的产卵季节），溪流与浅滩连成一片，成鱼游到浅滩区域产卵，这些卵孵化后，在浅滩生长，30～40 dpf时，这些小鱼开始迁移到溪流中生活（可能是因为食物需求增大），此时它们将面临溪流中的捕食者。综上推测：到了某个特定的发育阶段，斑马鱼需要适应新的栖息地，而那里生活着它们的捕食者，因而需要发展出更为有效的以化学信号为基础的反捕食行为，以适应新的生存环境（这可以视为外界环境压力），而与此对应的嗅觉受体的表达或者说相关神经环路的发展形成，则是环境压力下生命个体自身潜在机能的发展完善。此外，早期研究一般都是剥取鱼皮制备报警物质，本研究则是整鱼制备。近年来有研究表明，营养状况良好的个体与营养状况稍差的个体相比，表皮中包含有更多的报警物质［10］。因而，与鱼皮相比，用鱼体质量来衡量报警物质的相对浓度可能更为精确。

本文通过比较检测28、35、42 dpf 3个不同发育时期斑马鱼幼鱼的报警反应，首次界定了实验室高密度养殖体系中斑马鱼报警反应出现的发育时期，并结合已知的野外斑马鱼生活史，推测斑马鱼在特定的发育阶段产生报警反应可能与栖息地迁移有关。这将有利于我们进一步理解自然环境下，报警反应对个体生存以及提升种群适合度的重要意义。后续工作将对报警物质的理化性质做进一步的研究，并同时开展报警物质的鉴定工作，报警物质对应的嗅觉受体也有待进一步的研究。

［1］ MACEDONIA JM，EVANSCS.Essay on contemporary issues in ethology：Variation among mammalian alarm call systems and the problem of meaning in animal signals［J］.Ethology，1993，93（3）：177－197.

［2］ SMITH R J F.Evolution of alarm signals：Role of benefits of retaining group members or territorial neighbors［J］.American Naturalist，1986：604－610.

［3］ SHERMAN PW.Nepotism and the evolution of alarm calls［J］.Science，1977，197（4310）：1246－1253.

［4］ KLUMP G M，Shalter M D.Acoustic behaviour of birds and mammals in the predator context；I.Factors affecting the structure of alarm signals.II.The functional significance and evolution of alarm signals［J］.Zeitschriftfür Tierpsychologie，1984，66（3）：189－226.

［5］ ROTTMAN S J，SNOWDOWN C T.Demonstration and analysis of an alarm pheromone in mice［J］.Journal of Comparative and Physiological Psychology，1972，81（3）：483.

［6］ CHIVERS D P，SMITH R J F.Chemical alarm signalling in aquatic predator-prey systems：A review and prospectus［J］.Ecoscience，1998：338－352.

［7］ JACOBSEN H P，STABELL O B.Antipredator behaviour mediated by chemical cues：The role of conspecific alarm signalling and predator labelling in the avoidance response of a marine gastropod［J］.Oikos，2004，104（1）：43－50.

［8］ HAY M E.Marine chemical ecology：Chemical signals and cues structuremarine populations，communities，and ecosystems［J］.Annual Review of Marine Science，2009（1）：193.

［9］ VON FRISCH K.Zurpsychologie des fisch-schwarmes［J］.Naturwissenschaften，1938，26（37）：601－606.

［10］ VON FRISCH K.Über einen Schreckstoff der Fischhaut und seine biologische Bedeutung.Z［J］.Journal of Comparative Physiology，1942，29（1）：46－145.

［11］ SMITH R JF.Alarm signals in fishes［J］.Reviews in Fish Biology and Fisheries，1992，2（1）：33－63.

［12］ PFEIFFERW.The fright reaction in North American fish［J］.Canadian Journal of Zoology，1963，41（1）：69－77.

［13］ WALDMAN B.Quantitative and developmental analyses of the alarm reaction in the zebra danio，Brachydanio rerio［J］.Copeia，1982：1－9.

［14］ SPEEDIE N，GERLAIR.Alarm substance induced behavioral responses in zebrafish（Danio rerio）［J］.Behavioural Brain Research，2008，188（1）：168－177.

［15］ BASS S L S，GERLAIR.Zebrafish（Danio rerio）responds differentially to stimulus fish：The effects of sympatric and allopatric predators and harmless fish［J］.Behavioural Brain Research，2008，186（1）：107－117.

［16］ BLANCHARD D C，GRIEBEL G，BLANCHARD R J.Conditioning and residual emotionality effects of predator stimuli：Some reflections on stress and emotion［J］.Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry，2003，27（8）：1177－1185.

［17］ MCHENRY M J，FEUTL K E，STROTHER JA，etal.Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator＇s strike［J］.Biology Letters，2009：rsbl.2009.0048.

［18］ LINDSAY SM，VOGTR G.Behavioral responses of newly hatched zebrafish（Danio rerio）to amino acid chemostimulants［J］.Chemical Senses，2004，29（2）：93－100.

［19］ DARROW K O，HARRISW A.Characterization and development of courtship in zebrafish，Danio rerio［J］.Zebrafish，2004，1（1）：40－45.

［20］ MACK-BUCHER J A，LI J，FRIEDRICH R W.Early functional development of interneurons in the zebrafish olfactory bulb［J］.European Journal of Neuroscience，2007，25（2）：460－470.

［21］ SPENCE R，FATEMA M K，REICHARD M，et al.The distribution and habitat preferences of the zebrafish in Bangladesh［J］.Journal of Fish Biology，2006，69（5）：1435－1448.

［22］ ENGESZER R E，PATTERSON L B，RAO A A，et al.Zebrafish in thewild：A review of natural history and new notes from the field［J］.Zebrafish，2007，4（1）：21－40.

［23］ ARIMACHALAM M，RAJA M，VIJAYAKUMAR C，et al.Natural history of zebrafish（Danio rerio）in India［J］.Zebrafish，2013，10（1）：1－14.

Alarm response at specific developmental stage in zebrafish（Danio rerio）

CAO Xiao-long，ZU Yao，ZHANG Qing-hua，JIA Liang，LIWei-ming
（Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Ministry of Education，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China）

For many species the injured skin of fish under attack can release alarm substances that alert conspecifics of the presence of a predator and perform alarm response.The alarm substance is thought to be beneficial for the survival of the receiving individual，and to improve the inclusive fitness of releaser.Previous research showed that the alarm response usually appears in a specific developmental stage.In the present study，we tested behavioral response of zebrafish at three developmental stages（28 dpf，35 dpf and 42 dpf）to extracts of crushed conspecific individuals（10－6g body mass·L－1）.Two indicators were measured：percent of time on bottom（time of bottom）and percentof time at freezing state（time of freezing）.Our results showed that，at28 dpf，the responses of treatment group（extracts of crushed conspecific）did not differ from those of various control groups.In this stage，two individuals displayed“bottom”but only one displayed“freezing”.At 35 dpf，the treatment group showed a higher percentage of time spent on bottom than the control groups（P＜0.05）.At this stage，five individuals displayed“bottom”but only one displayed“freezing”.At 42 dpf，the treatment group showed higher percentages of time spent on both bottom and freezing state than control groups（P＜0.05）.At this stage，eight individuals displayed“bottom”and all of them displayed“freezing”.Themajority of individuals in the treatment group at this time started to show the alarm response.We conclude that zebrafish start to display alarm responses between 35－42 dpf.Considering the context of known wild zebrafish life history，we speculate that zebrafish alarm response appears at specific developmental stage when theymigrate to a different habitat.

zebrafish；alarm response；developmental stage；habitat

S 943

A

1004－2490（2016）03－0304－07

2015－10－23

中美海洋研究中心项目（A1－0209－13－0805）；水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心项目（ZF1206）；上海市科委扬帆计划（15YF1405000）

曹小龙（1988－），男，硕士研究生，研究方向为鱼类信息素通讯。E-mail：woin99＠126.com

李伟明，教授。E-mail：liweim＠shou.edu.cn