利用3个F2群体整合高密度栽培种花生遗传连锁图

郭建斌　黄　莉　成良强　陈伟刚　任小平　陈玉宁　周小静沈金雄　姜慧芳,*

1中国农业科学院油料作物研究所 / 农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室, 湖北武汉 430062;2华中农业大学植物科学技术学院, 湖北武汉 430070



利用3个F2群体整合高密度栽培种花生遗传连锁图

郭建斌1,2黄莉1成良强1陈伟刚1任小平1陈玉宁1周小静1沈金雄2姜慧芳1,*

1中国农业科学院油料作物研究所 / 农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室, 湖北武汉 430062;2华中农业大学植物科学技术学院, 湖北武汉 430070

摘要:遗传图谱的构建及整合是开展花生分子育种研究的基础, 利用多个作图群体整合遗传图谱是解决图谱标记密度低的有效途径。本研究采用基于锚定SSR标记的作图策略, 构建3个F2群体3张遗传连锁图, 利用JoinMap 3.0软件整合图谱, 获得一张包含20个连锁群、792个位点、总遗传距离为2079.50 cM, 标记间平均距离为2.63 cM的整合图谱, 各连锁群标记数在20～66个之间, 遗传距离在59.10～175.80 cM之间。将3个分离群体中检测到的与荚果及种子大小相关的QTL区段与整合连锁图的标记比较发现, 各群体中检测到的位于各染色体上的QTL在整合图谱中都能出现, 有些QTL标记区间在整合图谱中存在更多的标记, 为今后利用这些标记进行精细定位奠定了基础。

关键词:花生; SSR; 整合图谱

本研究由国家自然科学基金项目(31271764, 31371662, 31471534, 31461143022), 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2011CB109300), 农业部农作物种质资源保护项目(NB2010-2130135-28B)和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-14-花生种质资源评价)。

This study was supported by the Natural Science Foundation of China (31271764, 31371662, 31471534, 31461143022), the National Key Basic Research Program of China (973 Program), the Crop Germplasm Resources Protection Project (NB2010-2130135-28B), and the China Agriculture Research System (CARS-14-peanut germplasm resource evaluation).

第一作者联系方式: E-mail: guojb@webmail.hzau.edu.cn, Tel: 13007123983

花生(Arachis hypogaea L.)是我国乃至世界范围内广泛种植的经济作物和油料作物, 花生仁中含有丰富的脂肪和蛋白质, 具有很高的营养价值和经济价值。栽培种花生是异源四倍体(AABB, 2n = 4x = 40), 其基因组比较大, 遗传多样性缺乏[1], 有关花生遗传图谱构建、基因定位和重要性状QTL的研究

分析相对滞后。但是近年来, 随着分子标记技术的发展, 其遗传图谱构建和重要性状的QTL定位取得了很大进展。遗传图谱的构建是分子辅助育种乃至基因定位和图位克隆的基础。分子标记遗传连锁图谱为花生QTL和基因定位等研究奠定了基础, 如花生抗病、抗逆、产量和品质等的QTL或基因定位均借助于分子标记遗传连锁图谱。姜慧芳等[2]利用重组近交系群体检测花生青枯病抗性SSR标记, 获得一张包含8个连锁群的栽培花生部分遗传图谱, 总长603.9 cM。彭文舫等[3]利用远杂9102和Chico杂交构建重组自交系群体, 构建了一张包含98个AFLP标记、总长为285 cM的栽培种花生AFLP遗传连锁图谱。洪彦彬等[1]以粤油13×阜95-5为杂交组合构建重组自交系, 得到了一张包含108个标记,涉及20个连锁群, 总长568 cM, 平均距离为6.45 cM的花生遗传图谱。虽然花生遗传图谱的构建取得了一定的进展, 但是覆盖基因组不全, 图谱密度不高, 缺乏通用性和实用性。为得到高密度的花生遗传图谱, 图谱的整合是重要途径。图谱整合是为了弥补单个作图群体因分子标记多态性的局限性而难以构建高密度图谱的有效方法。Qin等[4]对2个RIL群体的遗传图谱进行整合, 得到了一张包含21个连锁群, 324个标记, 总遗传距离为1352.10 cM的遗传图谱。Gautami等[5]以3个RIL群体及3215个SSR标记, 构建了一张包含293个SSR位点、涉及20个连锁群, 全长2840.80 cM, 平均标记密度为9.70 cM的遗传图谱。张新友[6]以郑8903×豫花4号为杂交组合构建重组自交系群体, 结合郑9001×郑8903、白籽×豫花4号、开农白2号×豫花4号3个作图群体,以共有标记为基础, 构建了一张包含17个连锁群、101个标记、总长为953.88 cM的栽培种花生遗传图谱。选择适宜群体进行遗传连锁图的构建和整合,得到高密度的遗传连锁图谱, 有助于更多的QTL定位或基因分析。

本研究拟在3个与荚果和种子大小相关的F2分离群体的遗传图谱基础上, 利用共同标记作为锚定标记, 整合高密度的花生分子遗传连锁图谱, 分析单个分离群体的QTL及在整合图谱上的位置, 为分析不同种质间QTL的差异奠定基础。

1　材料与方法

1.1作图亲本

徐花13属中间型、中早熟大粒品种; 中花6号属珍珠豆型早熟中小粒品种。富川大花生是龙生型地方品种, 种子大小中等; ICG6375是来自ICRISAT的珍珠豆型小粒材料。中花10号是珍珠豆型早熟中粒花生品种; ICG12625是来自ICRISAT引进的多粒型品种。

1.2作图群体

FI群体是以富川大花生为母本、ICG6375为父本杂交得到的含有218个单株的F2群体。XZ群体是以徐花13为母本、中花6号为父本杂交得到的含有282个单株的F2群体。ZI群体是以中花10号为母本、ICG12625为父本杂交得到的含有232个单株的F2群体。

1.3基因组DNA提取及PCR扩增

在花生苗期取幼嫩叶片, 采用CTAB法提取基因组DNA。所用引物为查阅文献[7–11]的图谱上的和本实验室新开发的SSR引物, PCR体系10 μL, 含10～20 ng模板DNA 2 μL、Mix 2.5 μL (由北京全式金生物技术有限公司生产)、ddH2O 5 μL、10～40 pmol L–1SSR引物0.5 μL, PCR程序为Touchdown, 扩增条件为94℃预变性3 min; 93℃变性30 s, 65℃退火30 s, (每个循环–1℃), 72℃延伸1 min, 共10个循环; 93℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 共20个循环; 72℃延伸10 min。PCR产物变性后经6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 银染显影。

1.4基因型统计及遗传连锁图构建

与母本相同的带型记为“A”, 与父本相同的带型记为“B”, 同时具有双亲带型的记为“H”, 缺失的带型记为“-”。采用JoinMap 3.0软件绘制遗传图谱和整合图谱。设置LOD≥2, 步长为0.5, 在2.0～20.0 的LOD值范围内对所有标记分组, 并利用Kosambi函数将重组率转换为图谱距离(cM), 构建遗传图谱。比较不同群体中各个连锁群上共有的SSR标记并将此标记作为锚定标记, 利用JoinMap 3.0进行各连锁群的整合。

1.5表型性状考察及QTL定位

将F2材料种植于中国农业科学院油料作物研究所试验农场, 常规田间管理。单株收获, 晒干后随机选取10个成熟饱满的荚果紧密排成直线, 中间不留空隙, 测量荚果长和荚果宽。重复3次, 计算平均值。取每个荚果果嘴部分的种子, 将10个成熟饱满种子紧密排成直线, 中间不留空隙, 测量种子长和种子宽。重复3次, 计算平均值。结合构建的遗传连锁图, 采用WinQTLcart 2.5软件的复合区间作图

法进行QTL定位和效应估计。

2　结果与分析

2.1SSR多态性分析

选用的和本实验室开发的SSR引物信息见表1,筛选亲本间具有多态性的引物检测F2群体, 结果表明, ZI群体的多态性引物相对较多, 为13.94％; XZ群体的多态性引物相对较少, 只有10.39％。各群体的多态性引物比例列于表1。

2.2F2群体的遗传连锁图谱构建

以F2基因型数据为基础, 利用JoinMap 3.0软件进行遗传连锁分析, 构建了3张遗传连锁图。FI群体的连锁图包含22个连锁群(分别命名为LGF1～ LGF22), 347个位点, 图谱总长度为1675.6 cM, 连锁群上标记间平均距离变异范围为2.8～12.0 cM, 总的标记间平均距离为5.7 cM, 不同连锁群上标记数差异较大, 标记数最少的只有6个, 最多的有26个标记。XZ群体的连锁图包含22个连锁群(分别命名为LGX1～LGX22), 228个位点, 图谱总长为1337.7 cM, 标记间平均距离为7.2 cM, 标记数最少的连锁群只有3个标记。ZI群体的图谱包含20个连锁群(分别命名为LGZ1～LGZ20), 470个位点, 图谱总长为1877.3 cM, 标记间平均距离为4.0 cM, 标记分布比较均匀。3张连锁图的基本信息列于表2。

表1　3个花生F2群体多态率Table 1　Percentage of polymorphic primers tested in three populations

将所构建的3张遗传连锁图分别与Shirasawa 等[15]根据16个群体整合的栽培种(目前标记密度最高的栽培种花生)遗传图谱比较, 发现LGF1～LGF22能对应到Shirasawa (2013)整合图的A1～A10和B1～ B10, LGX5～LGX22能对应到Shirasawa整合图的A1～A10和B2～B6、B9～B10, LGZ1～LGZ20能对应到Shirasawa整合图的A1～A10和B1-B10。因此, 为了方便图谱的整合, 将LGF1～LGF22分别命名为FA1～ FA10、FB1～FB10、FA7a和FB7a, 将LGX5～LGX22分别命名为XA1～XA10、XB2～FB6、XB9～FB10和XB3a, 将LGZ1～LGZ20分别命名为ZA1～ZA10、ZB1～ZB10。

2.3图谱整合

分析所构建的3张花生F2群体遗传连锁图, 两两相互比较, 统计各连锁群上共有的SSR标记(表3)。FI与ZI群体之间各对应连锁群的共有标记数较多, 最多的有14个, 而ZI与XZ之间、FI与XZ之间各对应连锁群的共有标记要少些。

以上述3张F2连锁图上共有的SSR标记作为锚定标记, 利用JoinMap 3.0软件进行图谱整合, 得到了一张包含20个连锁群(分别命名为IA1～IA10、IB1～IB10), 792个位点的整合图谱(图1)。图谱总长为2079.50 cM, 标记间平均距离为2.63 cM。连锁群长度介于59.10～175.80 cM范围内, 不同连锁群上标记数分布相对比较均匀, 各连锁群标记数在20～66个之间, 连锁群上标记间平均距离变异范围为1.70～ 5.40 cM。最长的连锁群是LG13 (175.80 cM), 同时也是标记最多的连锁群(66个), 标记间平均距离为2.66 cM。标记密度最大的LG1连锁群, 标记间平均距离只有1.70 cM。整合图谱的基本信息列于表4。

将本研究整合的图谱与Shirasawa (2013)整合的栽培种遗传图谱比对, 发现本研究整合图谱的20个连锁群能够与Shirasawa根据16个群体整合图谱的20个连锁群一一对应(表4)。本研究整合的图谱中有382个标记在Shirasawa整合的20个连锁群上, 还有410个标记是Shirasawa整合图谱中没有的。

2.4花生荚果大小和种子大小QTL定位

从表5可以看出, 3个群体的亲本及其后代在荚果及种子大小方面均存在较大差异。

利用上述3张F2遗传图谱, 通过软件WinQTLcart 2.5采用复合区间作图法, 分别对3个F2群体的荚果长、荚果宽、种子长、种子宽共4个性状进行QTL定位分析表明, 以FI群体共检测到18个QTL, 分布在5个连锁群上。以XZ群体共检测到13个QTL, 分布在4个连锁群上。以ZI群体共检测到10个QTL, 分布在8个连锁群上(表6)。

(图1)

图1　花生遗传连锁图谱Fig. 1　Linkage maps of peanut

表3　3个图谱相互比较共有标记数Table 3　Numbers of common markers among three individual maps

表4　标记在连锁群上的分布Table 4　Distribution of markers in the linkage groups

表5　亲本及F2代群体性状差异Table 5　Variation of the pod and seed size in the parents and F2populations (cm)

在与荚果长相关的QTL中, 以FI群体检测到4 个QTL, 分别位于A05和A07两条染色体上, 贡献率为5.7％～26.1％。以XZ群体也检测到4个QTL, 分别位于A05和A09两条染色体上, 贡献率为4.1％～ 7.8％。以ZI群体检测到1个QTL, 位于B09染色体上, 贡献率为11.2％ (表6)。将检测到的QTL区段与本研究整合的连锁图比较发现, 通过FI群体检测到的位于A5染色体上的3个QTL (qPLA5.1a、qPLA5.1b、qPLA5.1c)区段及通过XZ群体检测到的同样位于A5染色体上的QTL (qPLA5.2)区段出现在整合图谱A05染色体上, 以XZ群体检测到的位于A9染色体上的3个QTL (qPLA9.2a、qPLA9.2b、qPLA9.2c)区段出现在整合图谱A09染色体上, 以FI群体检测到的位于A07染色体上的QTL (qPLA7.1)区段和以ZI群体检测到的位于B09染色体上QTL (qPLB9.3)区段在整合图谱相对应的染色体上也都能出现。

在荚果宽方面, FI、XZ和ZI 3个群体中分别检测到6个、4个和2个相关的QTL, 贡献率分别为7.42％～16.14％、4.48％～8.78％和2.10％～18.70％ (表6), 各群体中检测到的位于各染色体上的QTL在整合图谱中都能出现。与此类似, 3个群体中分别检测到与种子长相关的QTL 4个、2个和3个, 贡献率分别为5.66％～20.80％、3.03％～4.87％和9.86％～10.48％;与种子宽相关的QTL 4个、3个和4个, 贡献率分别为7.42％～12.6％、3.77％～9.76％和6.39％～12.20％ (表6)。各群体中检测到的位于各染色体上的QTL在整合图谱中都能出现。

不同性状的QTL存在置信区间重叠现象, 如FI群体中检测到的位于A05染色体上与荚果长相关的QTL (qPLA5.1a、qPLA5.1b、qPLA5.1c)和与种子长相关的QTL (qSLA5.1a、qSLA5.1b、qSLA5.1c)在相同区段。用XZ群体在区段GM1577～ARS141内检测到了与荚果长、荚果宽和种子长相关的QTL (qPLA5.3、qPWA5.3、qSLA5.3)(表6)。XZ群体A09染色体上的区间EM87～ARS768和区间AGGS1925～ AGGS2572内都存在与荚果长和荚果宽相关的QTL。如区间EM87～ARS768内存在控制荚果长的QTL (qPLA9.2a)和控制荚果宽的QTL (qPWA9.2a)(表6)。这些重叠的QTL在整合图谱中也存在重叠现象, 这可能与不同性状之间存在相关性有关。

3　讨论

随着分子标记开发技术的发展, 国内外都开展了关于花生抗病、抗逆、产量和品质性状QTL的研究, 以期将其应用于花生分子标记辅助选择育种。而遗传图谱是研究QTL定位乃至基因克隆的基础。Varshney等[12]利用TAG24与GPBD4杂交得到含有266个RIL的群体构建了一张含有188个SSR标记的栽培种花生遗传连锁图。Wang等[13]利用栽培种花生Tifrunner×GT-C20杂交F2代群体构建了覆盖1674.4 cM、含有318个标记位点及21个连锁群的遗传图。随着更多SSR标记的开发, 更多的基于SSR标记的遗传图谱被构建[4,14-16]。但是, 总体看来, 花生的遗传图谱还很不完善, 目前利用单个遗传群体通过SSR标记构建的密度达500个以上标记的图谱很少, 因此, 有必要通过多个遗传群体整合高密度的遗传连锁图。本研究利用3个F2群体构建的3张遗传图谱的密度分别为347、228和470个标记, 通过3张图谱的整合, 得到了一张包含792个SSR位点的遗传连锁图。由此可见, 图谱整合能够有效增加图谱密度, 为重要性状的精细定位奠定了基础。Shirasawa等(2012)以11个栽培种花生分离群体为基础, 整合了一张包含897个SSR标记的连锁图。可见本研究所涉及群体的差异比Shirasawa等(2012)所涉及群体的差异大, 在整合图谱方面的效率较高。Shirasawa等(2013)又增加了2个栽培种花生群体和3个野生花生群体共16个群体构建了目前密度最高的遗传图谱, 包含3693个标记位点, 其中, 绝大部分位点来源于野生花生群体。虽然本研究整合图谱密度没有Shirasawa等(2013)整合图谱高, 但有410个标记位点是Shirasawa等(2013)整合图谱中没有的。这410个标记位点在本研究整合图谱连锁群上的分布相对比较均匀, 其中有85个标记位点是本实验室新开发的(新引物的信息将近期另文发表)。本研究构建的遗传图谱上的标记与Shirasawa等(2013)整合图谱标记差异的原因, 可能是不同群体的遗传背景不一样, 所筛选到的差异性引物也就不同, 进而构建遗传图谱的标记也是有差异的。另外, 还有新开发的标记在Shirasawa等(2013)整合图谱中没有使用。本研究整合图谱中的绝大多数标记的顺序与Shirasawa等(2013)整合图谱的顺序一致。因此, 本研究整合的图谱为今后整合更高密度的连锁图奠定了基础。

整合图谱包含了不同群体的基因组信息, 为不同群体性状的基因或QTL相互比较提供了可能性。如以FI群体在A05染色体上检测到的与荚果宽相关

的QTL (qPWA5.1a, 相邻标记为AHGS1904-2～ AHGS1341)和以XZ群体在A05染色体上检测到的与荚果宽相关的QTL (qPWA5.2, 紧密连锁的标记为GM1577)在整合图谱上均出现了, 但他们位于不同的标记区间, 因此, 有可能是不同的QTL。从另一方面看, 单个群体定位结果与整合图谱相比较, 整合图谱位点区间内包含有更多的分子标记。如在FI群体A09连锁群上与种子长相关的位点AHGS1341～ pPGPseq9A7, 在整合图谱中发现此标记区间AHGS1341～pPGPseq9A7还存在另外的6个标记, 今后可以利用这些标记, 进一步将QTL的定位区间缩短。

表6　3个F2群体检中测到的QTLTable 6　QTL for the agronomic traits in three F2populations

4　结论

利用3个F2群体, 通过JoinMap 3.0软件, 整合得到一张包含20个连锁群、792个位点、总遗传距离为2079.5 cM、标记间平均距离为2.63 cM的栽培种花生遗传连锁图。

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URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151207.1041.016.html

An Integrated Genetic Linkage Map from Three F2Populations of Cultivated Peanut (Arachis hypogaea L.)

GUO Jian-Bin1,2, HUANG Li1, CHENG Liang-Qiang1, CHEN Wei-Gang1, REN Xiao-Ping1, CHEN Yu-Ning1, ZHOU Xiao-Jing1, SHEN Jin-Xiong2, and JIANG Hui-Fang1,*
1Oil Crops Research Institute of China Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China;2College of Plant Science & Technology of Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

Abstract:The genetic linkage map is important for peanut molecular breeding. Construction of integrating genetic linkage map using multiple populations is an effective approach to increase the marker density of map. Three maps were constructed with three F2populations, respectively in the present study. Based on anchored SSR markers in the three maps, we constructed a new map with 792 SSR loci and total map distance of 2079.50 cM (the average distance is 2.63 cM). The length of linkage groups varied from 59.10 to 175.80 cM, and the number of markers was from 20 to 66 in the integrated linkages groups. Comparing the intervals of QTLs linked to the pod size and seed size in the three F2populations with the markers in the integrated linkage groups, all the QTLs linked to the pod size and seed size could be found in the integrated map. Some intervals of QTLs had more markers in the integrated map than in the F2linkage groups in the present study. The markers in the intervals of QTLs of the integrated map could be used for fine mapping.

Keywords:Cultivated peanut; SSR; Integrated genetic mapping

收稿日期Received(): 2015-06-24; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(网络出版日期): 2015-12-07.

通讯作者*(Corresponding author): 姜慧芳, E-mail: peanut@oilcrops.cn, Tel: 027-86711550

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00159