葛根素对支气管哮喘疗效的实验研究

张淋筌，吴 鹏，曹交欢，马 骏，刘 杰，周纤纤，张坚松

（湖南师范大学医学院应用生理研究室，长沙 410006）

葛根素对支气管哮喘疗效的实验研究

张淋筌#，吴 鹏#，曹交欢，马 骏，刘 杰，周纤纤，张坚松

（湖南师范大学医学院应用生理研究室，长沙 410006）

目的：观察葛根素对支气管哮喘的治疗作用，探讨其初步治疗机制。方法：建立臭氧应激支气管哮喘大鼠模型，按低、中、高剂量对大鼠进行灌药，观察大鼠生理活动状况；并进行肺泡灌洗液细胞计数和肺部气道组织切片观察，统计细胞总数、嗜酸性粒细胞数和中性粒细胞数。结果：葛根素能显著减弱大鼠哮喘症状，减少肺部炎症细胞浸润，也可介导气道正常修复，修复程度与给药剂量水平成正相关。结论：葛根素对支气管哮喘有较好的治疗效果，其机制可能与抗气道炎症和调节凝血平衡紊乱有关。

葛根素；支气管哮喘；SD大鼠；慢性炎症

葛根素（8-β-D-葡萄吡喃糖-4'，7-二羟基异黄酮）是中药葛根中提取出的主要的大豆异黄酮成分［1，2］。葛根素具有抗炎［3，4］、抗氧化［5，6］、心血管保护［7，8］等作用，常用来作为抗炎药物使用，同时有改善凝血的特性以及心梗后胆碱能神经功能恢复的功能［9］，广泛应用于临床心脑血管系统疾病［10］。然而对于葛根素治疗支气管哮喘的疗效记载相对不是很充分，正因为如此，对葛根素的具体治疗支气管哮喘的疗效需进一步进行相关的实验进一步加以确认。本研究通过建立臭氧应激支气管哮喘大鼠模型，分析葛根素对支气管哮喘的疗效及相关机制

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物健康SD大鼠60只，体重220±20g，由湖南天勤生物技术有限公司提供。

1.1.2 实验主要试剂及器材99%葛根素（干粉），地塞米松溶液（1mg/mL），生理盐水，4% 甲醛溶液，酒精，25%乌拉坦，二甲苯，HE染色试剂盒，石蜡，加拿大树胶；熔蜡箱，离心管，小纸盒，切片机，冷冻台，包埋机，恒温箱，冰箱，病理图像分析仪，臭氧发生器。

1.2 试验方法

1.2.1 分组与模型建立将60只SD大鼠分为六组（每组10只），正常组：采用生理盐水进行灌注，不作其他处理；病理模型组：按照本室已有的方法［11］对大鼠进行臭氧应激1h/d，连续进行8d，每天应激完毕后观察大鼠生理活动状态。葛根素低、中、高浓度组，均采取病理模型组相同处理的基础上，按100mg/kg的标准对低浓度组灌药+1ml生理盐水腹腔注射，中浓度组灌2倍剂量，高浓度组灌3倍剂量；DEX组灌1ml生理盐水+1mL地塞米松（0.5mg/kg）腹腔注射。

1.2.2 支气管肺泡灌洗液（bronchoalvage lavage fluid，BALF）中细胞分类计数取大鼠一只，称重后腹腔注射25%乌拉坦麻醉仰卧固定，行胸腔打开手术，剪除胸骨暴露心脏，从心尖处抽干外周血致死。分离出颈部气管，在气管下段作一小T形切口，将气管插管缓缓插入，进程中如遇轻微阻力，表明插管到达气管隆突部位，向左旋转插管，稍用力后即可进入左主支气管，待再次遇到阻力时停止插管，用37℃无菌生理盐水3mL正压缓慢注入肺内，可见大鼠左肺逐渐变得膨隆、苍白，缓慢回收支气管肺泡灌洗液，再将所得液体缓缓注入肺内，如此反复5次，最后一次注入后回收灌洗液，置于15mL的塑料离心管中（保存于冰浴中），此为第一次灌洗，然后重复4 次上述操作。将所得标本计量后，于4℃ 1500 r/min，离心15min，上清液-70℃保存备用，细胞沉淀用溶红细胞液悬浮，4℃ 1500r/min，离心10 min，弃上清，生理盐水再次悬浮细胞沉淀，在光学显微镜下进行细胞计数，涂片Wright-Giemsa染色后，在油镜下至少计数200个细胞。

1.2.3 肺部气道观察大鼠抽血致死后结扎主动脉、肺动脉，小心取出全部肺组织，用生理盐水洗去表面浮血。沿肺门处剪下整叶肺组织，用4%多聚甲醛固定1d后常规制备病理切片，并进行HE染色。制片后于病理图像分析仪下观察气道变化程度并拍片对比。

1.3 统计学处理数据均以mean±SD表示，用SPSS19.0进行统计处理。统计学方法采用成组设计的t检验，以P＜0.01时判定差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞分类计数情况表1结果显示，与正常组比较，病理模型组白细胞总数、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞明显增加（P＜0.01）；与病理模型组比较，葛根素低浓度组、葛根素中浓度组、葛根素高浓度组及DEX组白细胞总数、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞明显降低（P＜0.05）；葛根素各浓度组与DEX组比较无明显差异。

表1 大鼠BALF白细胞总数、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞计数

2.2 肺部气道观察结果根据相关文献资料［12］，以气道损伤程度、肺泡损伤程度及炎性细胞浸润程度作为参考项进行描述及比较。正常组肺组织切片（A），气道形状正常，气道平滑肌无异常，无杯状细胞形成附着，肺泡组织基本完整，周围无或少量炎性细胞浸润；病理模型组（B）与正常组相比，气道损伤明显，气道平滑肌异常肥大，可见一定量杯状细胞，肺泡组织损伤面大，炎性细胞浸润程度高；葛根素低浓度组（C）与病理模型组相比，在葛根素作用下，气道结构及肺泡组织有修复迹象但不显著，炎性细胞浸润程度肉眼可见降低；葛根素中浓度组（D）气道组织形态基本恢复正常（气道边缘修复、杯状细胞数目减少等），肺泡组织有肉眼可见修复程度，炎性细胞浸润程度显著降低；葛根素高浓度组（E）气道组织及肺泡组织已基本修复至正常状态，炎性细胞浸润程度大幅度降低；DEX组（F）炎性细胞浸润程度大幅度降低，气道组织有少量修复迹象，肺泡组织修复不明显。

图1 不同组肺组织切片的视图（HE染色，×200）正常组肺组织切片（A）；病理模型组（B）；葛根素低浓度组（C）；葛根素中浓度组（D）；葛根素高浓度组（E）；DEX组（F）

3 讨论

支气管哮喘是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症［13］，是临床十分典型的慢性呼吸道疾病。随着病情的发展一些患者还会经历肺功能进行性减弱，这是由于慢性炎症会启动气道重建过程，其特点包括：粘液过度分泌、上皮剥落、平滑肌肥厚、纤维化等［14］，因此支气管哮喘经常导致高发病率和高死亡率。以往的哮喘治疗方案多以控制气道炎症为主，但不能根治，且哮喘气道炎症反复发作，极可能与哮喘凝血平衡紊乱有关，凝血平衡的紊乱对过敏性炎症的永存状态十分重要［11］，必须要从控制炎症与调节凝血平衡紊乱两方面同时进行治疗。糖皮质激素在炎症控制方面有卓越的疗效，但时效低且对组织修复无明显促进作用，且存在有相当的副作用。而天然药物葛根素在疗效上满足抗炎症与改善凝血双方面，且副作用要小于激素类药物治疗，理论上是治疗哮喘的理想药物。

在对哮喘大鼠模型进行葛根素干预后，根据实验结果，中、高剂量葛根素理论上有短期直接的疗效，可使哮喘症状在短期内迅速缓解；根据BALF细胞计数结果，葛根素低、中、高剂量组在总细胞数、嗜酸性粒细胞数及中性粒细胞数上都有着显著减少，即表明低剂量也有一定的疗效作用，若进行长期用药也有比较可观的疗效。在组织学方面，光镜下观察各组大鼠肺组织病理切片，与正常组大鼠相比，病理模型组大鼠可见支气管管壁增厚，管腔内分泌物增多以及大量的嗜酸细胞、淋巴细胞等浸润，同时可见气道管腔杯状细胞增生，黏膜不规则增生，皱褶减少，伴随有不同程度的肺泡组织破损；经葛根素干预后，哮喘大鼠肺组织支气管管壁增厚程度、炎症细胞浸润程度等也明显减轻，并伴有肺泡组织的修复，表明葛根素在气道重建过程中也起到了往正常方向介导修复的作用。

本实验所有结果均可在一定程度上证明葛根素在治疗哮喘方面具有一定作用，为未来治疗以哮喘为主的慢性呼吸道疾病药物研发提供一定的参考依据。

［1］ Yong Pil Hwang, Chul Yung ChoP, Young Chul Chung, et al. Protective Effects of Puerarin on Carbon Tetrachloride-lnduced Hepatotoxicity. Arch Pharm Res, 2007, 30(10): 1309-1317.

［2］ 刘逢芹, 董其亭, 李宏建, 等. 野葛根、藤及其提取物中相关异黄酮成分的含量测定［J］. 中国中药杂志, 2007, 32(14): 1487-1489.

［3］ Lim DW, Lee C, Kim IH, et al. Anti-inflammatory effects of total isoflavones from Pueraria lobata oncerebral ischemia in rats［J］. Molecules, 2013, 18(9), 10404-10412.

［4］ Mao CP, Gu ZL. Puerarin reduces increased c-fos, c-jun, and type IV collagen expression caused by high glucose in glomerular mesangial cells［J］. Acta Pharmacol Sin, 2005, 26(8): 982-986.

［5］ Jin SE, Son YK, Min BS, et al. Anti-inflammatory and antioxidant activities of constituents isolated fromPueraria lobata roots［J］. Arch Pharm Res, 2012, 35(5): 823-837.

［6］ 宋淑珍, 田亚平, 王成彬, 等. 葛根总黄酮对实验性哮喘大鼠的预防效应［J］. 中国临床康复, 2005, 9(19): 129-132.

［7］ Shi RL, Zhang JJ. Protective effect of puerarin on vascular endothelial cell apoptosis induced by chemical hypoxia in vitro［J］. Yao Xue Xue Bao.2003, 38(2): 103-107.

［8］ 魏述永. 葛根素心血管保护作用及其机制研究进展［J］. 中国中药杂志, 2015, 40(12): 2278-2284.

［9］ 倪秀芹, 李星, 赵玲辉, 等. 中西药结合促进心梗后大鼠胆碱能神经的恢复［J］. 中国临床解剖学杂志.2006, 6(24): 680-682.

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［11］ 李翔, 王笑梅, 张坚松. 两种气道高反应大鼠模型的建立与比较［J］.湖南师范大学学报(医学版), 2009, 6(1): 17-22.

［12］ Matute-Bello G, Downey G, Moore BB, et al. An official American Thoracic Societ Workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals［J］. Am J Respir Cell Mol Biol, 2011, 44(5): 725-738.

［13］ 支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗和管理方案)［M］. 中华哮喘杂志(电子版), 2008, (1): 3.

［14］ Elias JA, Zhu Z, Chupp G, et al. Airway remodeling in asthma［J］. J Clin Invest, 1999, 104(8): 1001-1006.

Experimental study of Puerarin on the therapeutic effect of bronchial asthma

Zhang Lin-quan, Wu Peng, Cao Jiao-huan, Ma Jun, Liu Jie, Zhou Xian-xian, Zhang Jian-song

(Research Department of Applied Pathophysiology, Medical College, Hunan Normal University, Changsha, 410006, China)

ObjectiveObserving therapeutic effect of puerarin to bronchial asthma, and discussion preliminary treatment mechanism.MethodsEstablished ozone stress rat model of allergic asthma, according to different doses to rats drench, and observed rats physiological activity status； then conducted bronchoalveolar lavage fluid cell count and observed lung airway tissue sections, counted number of total cells, eosinophils and neutrophils.ResultsPuerarin could significantly weaken asthma symptoms in rats, reduced lung inflammatory cell infiltration, also can mediate normally airway repair, repair degree and doses level to a positive correlation.ConclusionPuerarin on bronchial asthma have a better therapeutic effect, the mechanism may be associated with airway inflammation and regulate anti-coagulation balance disorders.

puerarin； bronchial asthma； rat； chronic inflammation

R562.25

A

1673-016X（2016）06-0001-03

2016-08-10

湖南省科技厅计划项目（2015SK2066）；2014年国家级大学生创新课题（NO.201410542015）

张坚松，E-mail：jwc_zjs@126.com