上海市猪源多杀性巴氏杆菌分离鉴定及其耐药性分析

刘东良，钟登科，李蓓蓓，赵秋华，张克龙，石 坤，魏建超

（1.湖南省冷水江市畜牧水产局，冷水江 417500；2.上海农林职业技术学院，上海 201600；3. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；4.上海市闵行区动物疫病预防控制中心，上海 201109）

·研究论文·

上海市猪源多杀性巴氏杆菌分离鉴定及其耐药性分析

刘东良1，钟登科2，李蓓蓓3，赵秋华4，张克龙3，石 坤3，魏建超3

（1.湖南省冷水江市畜牧水产局，冷水江 417500；2.上海农林职业技术学院，上海 201600；3. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；4.上海市闵行区动物疫病预防控制中心，上海 201109）

本研究旨在调查上海市猪源多杀性巴氏杆菌对临床常用抗菌药的耐药情况，为该病的药物预防与治疗提供科学依据。2014～2015年在上海市11个规模化养猪场采集疑似多杀性巴氏杆菌感染的病料共计116份，采用细菌分离培养及PCR方法，分离鉴定出20株多杀性巴氏杆菌。采用纸片法测定了分离菌株对20种临床常用抗菌药的敏感性，结果表明，所有菌株对阿莫西林克拉维酸、头孢曲松、恩诺沙星、氟苯尼考、阿奇霉素和多黏菌素B敏感，这6种药物可作为本地区控制本病的首选药物。然而，超过50%的菌株对青霉素（65.0%）、复方新诺明（65.0%）、氨苄西林（60.0%）、链霉素（60.0%）、四环素（60.0%）耐药。耐药谱分析显示，85.0%的菌株对4～7种抗菌药耐药。本研究结果表明上海市猪源多杀性巴氏杆菌对临床常用抗菌药物耐药较严重，应加强养殖场猪多杀性巴氏杆菌的耐药性监测与防控。

多杀性巴氏杆菌；分离；耐药；猪

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）是巴氏杆菌科巴氏杆菌属的一种革兰阴性短小杆菌，也是一种重要的具有广泛宿主范围的病原菌，对多种动物和人均有致病性，主要引起动物发生出血性败血症或传染性肺炎。猪是多杀性巴氏杆菌的易感动物之一，猪群中流行的多杀性巴氏杆菌血清型多为A型和D型，主要引发猪肺疫（porcine pasteurellosis）和猪萎缩性鼻炎（atrophic rhinitis，AR）[1]。

Pm广泛分布于世界各地，正常存在于多种健康动物的口腔和咽部黏膜。当动物处于应激状态、机体抵抗力低下时，Pm易大量繁殖，发生内源性传染[1-3]。近年来猪巴氏杆菌病在集约化猪场内发病率呈明显上升趋势，主要引起猪死亡、生长缓慢，饲料利用率降低等问题，尤其是Pm与其他病毒和细菌的混合感染和继发感染[4]，给养猪业带来巨大经济损失。目前猪巴氏杆菌病的控制主要依靠使用抗菌药，但临床上抗菌药的盲目使用，使得Pm对其已产生不同程度的耐药，这给该病的防控带来了极大的挑战。近年来，上海市部分规模化猪场多杀性巴氏杆菌的感染呈逐年上升趋势，为此，本研究对上海市11个规模化猪场进行猪多杀性巴氏杆菌的分离、PCR鉴定和耐药性分析，为该病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 培养基与试剂 胰蛋白大豆琼脂培养基（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白大豆肉汤培养基（tryptic soy broth，TSB）培养基购自英国Oxoid公司；新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）购自美国Sigma公司；2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker和细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；革兰氏染色液和瑞氏染色液均购自杭州天和微生物试剂有限公司；细菌药敏试纸购自英国Oxoid公司，包括青霉素（penicillin，PEN）、氨苄西林（ampicillin，AMP）、阿莫西林克拉维酸（amoxicillin-clavulanic acid，AMC）、头孢噻呋（ceftiofur，CEF)、头孢曲松(ceftriaxone，CRO)、恩诺沙星(enrofloxacin，ENO)、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP)、复方新诺明（sulfamethoxazole，SMZ）、克林霉素（clindamycin，CLI）、氟苯尼考(florfenicol，FFC)、链霉素（streptomycin，STR）、庆大霉素（gentamicin，GEN）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、阿米卡星（amikacin，AMK）、红霉素（erythromycin，ERY）、替米考星(tilmicosin，TIL)、阿奇霉素（azithromycin，AZM）、四环素（tetracycline，TET）、强力霉素（doxycycline，DOX）和多黏菌素B（polymyxin B，PB）共20种临床上常用的抗细菌药物。

1.2 样品来源 2014～2015年在上海市11个规模化养猪场，采集疑似多杀性巴氏杆菌感染的病死猪肺脏组织，共计116份。

1.3 细菌的分离培养 无菌采取的肺脏病变组织，划线接种于含5%新生牛血清和10 mg/L NAD的TSA平板，37℃培养18～24 h后观察菌落形态，挑取可疑单菌落进行传代纯化培养，取纯培养的单个典型菌落进行革兰氏染色和瑞氏染色，镜检观察细菌的形态和染色特点。

1.4 PCR鉴定 将上述初步鉴定后纯化的细菌按试剂盒说明书提取细菌基因组DNA为PCR模板，根据文献[5]中方法进一步做PCR鉴定，同时对分离菌株进行16S rDNA测序。针对Pm的Kmt1基因设计检测引物（Pm-F和Pm-R）和16 S rDNA的通用引物（27 F和1492 R）见表1，由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.5 药敏试验 按照常规的纸片法操作对上述20株多杀性巴氏杆菌进行药敏试验，通过测量各纸片的抑菌圈（mm）大小，参照美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）提供的判断标准[6]，确定这些多杀性巴氏杆菌分离株的耐药谱。

2 结果

2.1 病原菌的分离培养与镜检 从采集的116份病料中分离到20株疑似多杀性巴氏杆菌的病原菌，分别编号为Pm-1～Pm-20，它们在TSA平板上长成边缘整齐、表面光滑、湿润、直径1～2 mm的露珠状菌落。革兰氏染色呈单个或成对阴性短杆菌，瑞氏染色呈两极浓染球杆菌，多数为单个存在。

表1 分离菌株PCR鉴定所用引物Table 1 PCR primers used for species identif cation of isolates

2.2 多杀性巴氏杆菌PCR鉴定与测序 应用Pm特异性引物对20株分离菌株进行PCR初步鉴定，扩增产物均为457 bp的片段。同时对分离菌株16S rDNA进行扩增测序，证实其序列与Pm 16S rDNA序列相符，部分菌株PCR鉴定结果见图1。本研究共采集检测了116个样品，最终分离鉴定到20株Pm，分离率为17.24%。

图1 分离菌株的PCR鉴定结果Fig. 1 PCR identif cation result of clinical isolates

2.3 抗菌药物敏感性试验

2.3.1 抗菌药物敏感性 20株Pm对20种抗菌药的敏感性检测结果详见表2，所有菌株对阿莫西林克拉维酸、头孢曲松、恩诺沙星、氟苯尼考、阿奇霉素和多黏菌素B敏感，这6种药物可作为上海市控制本病的首选药物。参照NCCLS提供的判断标准，确定上述药物的耐药率大小顺序：青霉素、复方新诺明＞氨苄西林、链霉素、四环素＞强力霉素、克林霉素＞卡那霉素＞庆大霉素＞红霉素＞替米考星＞阿米卡星＞头孢噻呋、环丙沙星。总体而言，本研究中Pm对青霉素类、磺胺类、四环素类、氨基糖苷类药物耐药率相对较高，对林可酰胺类、大环内脂类和头孢菌素类也存在一定程度的耐药。

2.3.2 多重耐药性与耐药谱 根据药敏试验结果对分离菌株多重耐药性进行分析，本研究中Pm的主要耐药谱型有14种，耐4种药物的菌株数最多，85%的菌株对4～7种的抗菌药耐受，最多同时耐9种药物，结果见表3和表4。

3 讨论

猪多杀性巴氏杆菌是猪呼吸系统疾病综合征（porcine respiratory disease complex, PRDC）的重要致病原之一，在猪群中属于条件致病菌，即该菌是猪群的常在菌，在猪抵抗力低下时可侵入机体而发生内源性感染。Pm还可与多种病原混合协同感染，从而增加猪群呼吸道疾病的发病率和死亡率，造成极其严重的经济损失。本研究于2014～2015年从上海市11个疑似感染多杀性巴氏杆菌的规模化猪场，随机采集116份疑似病料，通过分离培养、染色镜检、PCR鉴定和16S rDNA序列测定，共分离20株猪多杀

性巴氏杆菌，分离率为17.24%。结果说明猪多杀性巴氏杆菌感染在上海市比较普遍，流行情况较为严重，已对该地养猪业构成潜在威胁，成为养猪业的重要呼吸道疾病之一，因此应引起各养猪场和动物防疫部门的高度重视。

表2 20株猪源多杀性巴氏杆菌分离株对20种药物的敏感性Table 2 The sensitivity of the P. multocida isolates to 20 antibacterial agents in this study

表3 20株猪源多杀性巴氏杆菌分离株的耐药谱Table 3 Drug resistance spectrum of the P. multocida isolates

表4 20株猪源多杀性巴氏杆菌分离株的多重耐药性Table 4 Multiple resistance of the P. multocida isolate

目前猪多杀性巴氏杆菌病的控制主要依靠使用抗生素，但在实际生产中长期盲目地误用、滥用抗生素，使得细菌耐药情况愈加突出，给该病的防治造成一定的困难。2000年以来，我国猪场发生疑似多杀性巴氏杆菌感染的报道陆续增多，特别是近几年急骤上升。廖素环等[7]对2009～2010年广西省5个地区分离的14株Pm进行药敏试验，发现大多数菌株对磺胺类、硝基呋喃类和林可胺类抗菌药的耐药率比较高，均在79%以上。桂文龙等[8]对2011～2012年苏中地区分离的21株猪进行耐药性分析，发现这些分离菌株对头孢氨苄、复方新诺明、红霉素、链霉素、青霉素G、四环素和林可霉素7种抗菌药物耐药较严重，耐药率在85%以上。本次调查中20株Pm对14种抗菌药物存在不同程度的耐药，上海市分离的20株Pm对青霉素类、磺胺类、四环素类、氨基糖苷类药物耐药率相对较高，对林可酰胺类、大环内脂类和头孢菌素类也存在一定程度的耐药，而且均存在多重耐药现象。其中对青霉素、复方新诺明、氨苄西林、链霉素、四环素、强力霉素、克林霉素的耐药率均在50%以上。因此，建议在实际生产中，采用细菌体外分离培养与鉴定确诊病原后，结合药敏试验结果有针对性的用药，避免盲目滥用、长期使用同种抗菌药物。同时可对养殖场进行定期细菌药敏监测，为临床用药提供数据支撑与指导。

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ISOLATION AND ANTIBIOTIC RESISTANCE OF PORCINE PASTEURELLA MULTOCIDA STRAINS IN SHANGHAI

LIU Dong-liang1, ZHONG Deng-ke2, LI Bei-bei3, ZHAO Qiu-hua4, ZHANG Ke-long3, SHI Kun3, WEI Jian-chao3

(1. Bureau of Animal Husbandry and Fisheries in Lengshuijiang City of Hunan Province, Lengshuijiang 417500, China; 2. Shanghai Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry, Shanghai 201600, China; 3. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 4. Minhang Center of Animal Disease Prevention and Control in Shanghai, Shanghai 201109, China)

The aim of this study was to investigate antibiotic resistance in porcine Pasteurella multocida isolates in Shanghai and to provide information for drug use in clinical treatment. Total 20 P. multocida strains were isolated from 116 swine samples in 2014-2015. All isolates were susceptible to amoxicillin-clavulanic acid, ceftriaxone, enrof oxacin, f orfenicol, azithromycin and polymyxin B. Some isolates were resistant to penicillin(65.0%), sulfamethoxazole(65.0%), ampicillin(60.0%), streptomycin(60.0%) and tetracycline（60.0%）. Total 17 strains were resistant to all of 4-7 antibiotics. The results of this study suggested that antibiotic resistance in porcine P. multocida isolates in Shanghai was prevailing. Therefore, it was necessary for monitoring and prevention of P. multocid infection in pigs.

Pasteurella multocida; isolation; antibiotic resistance; swine

S852.612

A

1674-6422（2016）06-0019-05

2016-06-28

上海市生猪产业技术体系建设项目 (沪农科产字2015第6号)；上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字（2013）第5-6号）

刘东良，男，兽医师，主要从事动物细菌疫病研究

魏建超，E-mail：jianchaowei@shvri.ac.cn