精子DNA碎片指数对体外受精—胚胎移植妊娠结局预测价值的研究

黄智勇 王立雅 谢春雨 陈亚军 陈艳 高松城 傅学文 余秋锋 邱雪芳

[摘要] 目的 探讨精子DNA碎片指数（DFI）对体外受精-胚胎移植（IVF-ET）妊娠结局的预测价值。 方法 选取2014年12月～2015年5月在本中心接受IVF-ET治疗的208对不孕夫妇作为研究对象，按照WHO标准，采用改良精子染色质扩散实验（SCD）对男方进行精子DFI检测，并根据精子DFI值将上述IVF-ET患者分为低DFI（<30%）组和高DFI（≥30%）组，分析各组的受精率、正常受精率、可利用胚胎率、优质胚胎形成率、优质胚胎移植率和妊娠结局。 结果 低DFI组与高DFI组的可利用胚胎率、优质胚胎形成率和优质胚胎移植率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。低DFI组的受精率、正常受精率和临床妊娠率显著高于高DFI组，差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。 结论 精子DFI与胚胎质量无关，其可影响IVF受精率和临床妊娠率。精子DFI检测可以作为精液质量的检测指标对体外受精结局进行预测。

[关键词] 精子DNA碎片指数；体外受精-胚胎移植；妊娠结局

[中图分类号] R711.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）02（a）-0097-03

Study of sperm DNA fragmentation index on predictive value of pregnancy outcome in vitro fertilization-embryo transplantation

HUANG Zhi-yong WANG Li-ya XIE Chun-yu CHEN Ya-jun CHEN Yan GAO Song-cheng FU Xue-wen YU Qiu-feng QIU Xue-fang

Center for Reproductive Medicine，Maternal and Child Health Care Hospital of Shaoguan City in Guangdong Province，Shaoguan 512026，China

[Abstract] Objective To explore the predictive value of pregnancy outcome in vitro fertilization （IVF）-embryo transplantation （ET） by sperm DNA fragmentation index （DFI）. Methods 208 pairs of infertile couples accepted the IVF-ET treatment in our center from May 2015 to December 2014 were selected as the research object，according to World Health Organization （WHO） standard，sperm DFI was tested by modified sperm chromatin dispersion （SCD） test.The above mentioned participants were divided into the low DFI group （<30%） and the high DFI group （≥30%） based on the value of sperm DFI.The rate of fertilization，the rate of normal fertilization，the usable embryo rate，the formation rate of embryo in high quality，the transplantation rate of embryo in high quality and pregnancy outcome in two groups was analyzed. Results There was no significant difference in the usable embryo rate，the formation rate of embryo in high quality，or the transplantation rate of embryo in high quality between the low DFI group and the high DFI group （P>0.05）.The rate of fertilization，the rate of normal fertilization and the clinical pregnancy rate in the low DFI group was higher than that in the high DFI group，with significant difference （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion Sperm DFI is not related with embryo quality，which can influence on IVF fertilization rate and clinical pregnancy rate.Sperm DFI detection can be considered as inspection index of semen quality used for prediction of IVF outcome.

[Key words] Sperm DNA fragmentation index；In vitro fertilization-embryo transplantation；Pregnancy outcome

目前，不明原因的受精失败时有发生，除卵子的因素外，精子也起到至关重要的作用。精液常规已不能很好地评估精子的情况，因此，对于精子DNA碎片的研究也逐渐升温。20世纪以来，随着我国工业化程度的提高，环境污染的逐渐加重、人精神压力的不断增大以及过多地接触一些化学物质均可能损伤男性精子。本研究选取在本中心进行体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transplantation，IVF-ET）助孕治疗的男性精液标本作为研究对象，检测其精子DNA碎片指数（DNA fragmentation index，DFI），并分析DFI与受精率、正常受精率、可利用胚胎率、优质胚胎形成率、优质胚胎移植率和临床妊娠率之间的关系，探讨DFI对于预测IVF-ET妊娠结局的指导意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年12月～2015年5月在本中心采用长方案超排卵治疗、IVF助孕的208对不孕夫妇作为研究对象。为排除女方因素的影响，有以下情况者不属于本研究范围：①女方年龄>40岁；②FSH>15 mIU/ml；③取卵<5个；④内膜厚度<7 mm。对男方精液进行DFI检测，按结果分为低DFI（<30%）组和高DFI（≥30%）组。

1.2 超排方案

采用常规长方案，于月经周期第19天或第20天开始，肌内注射促性腺激素释放激素激动剂（注射用醋酸曲普瑞林，天津博福-益普生制药有限公司）1.00～1.25 mg/次；14 d后检测血清检促卵泡激素（FSH）、黄体生成素（LH），达到降调标准后开始加用人绝经期促性腺激素（HMG或丽申宝，珠海丽珠制药）112.5～225.0 U，肌内注射8～12 d，当主导卵泡直径达到18 mm时肌内注射人绒毛膜促性腺激素（HCG，珠海丽珠制药）8000～10000 U，36～38 h取卵。

1.3 精液采集和处理

男方禁欲3～5 d，在取卵当日以手淫法收集精液，立即放置于37℃的恒温平台上，待精液完全液化后进行分析。采用密度梯度离心法+上游法对精液进行处理，取处理后的精液悬液采用精子染色质扩散法（SCD）检测DFI（精子DNA碎片检测试剂盒，深圳华康生物科技有限公司）。密度梯度离心法：将样品离心沉降，分离。上游法：利用活动精子具有游过液体界面进入不同培养液的能力，分离活力强的精子与死精子、凝集精子、畸形精子、白细胞及杂质。SCD步骤：①室温20～28℃，试剂盒室温下平衡30～60 min；②将低熔点琼脂糖管（含140 μl低熔点琼脂糖溶液）放入90～100℃水浴，至琼脂糖凝胶完全熔解，放置于37℃水浴箱至温度恒定；③采用精子稀释液将精子密度调至5×106～10×106个/ml，取60 μl加入低熔点琼脂糖管中，混匀；④取上述悬浮液30 μl滴入预处理载玻片，轻盖盖玻片，避免产生气泡，置于2～8℃冰箱4 min，整个过程要保持载玻片水平位置；⑤取出载玻片，移走盖玻片，迅速浸入变性液中7 min；取出后放入蒸馏水中浸泡5 s，然后取出载玻片并竖立，滤纸吸干水珠，要注意勿接触标本区域，载浸入裂解液中反应20 min；⑥反应毕，浸入洗涤液3 min，洗掉裂解液，再依次浸入70%、90%、无水乙醇溶液中脱水各2 min，自然晾干，瑞氏染色剂染色.染色后，蒸馏水冲洗10～15次，除去多余染色剂，风干，常规显微镜下观察。

1.4 受精、胚胎观察和移植

取卵当日常规进行IVF，受精后16～18 h进行观察，2PN（原核）为正常受精胚胎，0PN、1PN和≥3PN为异常受精胚胎。受精后48 h观察胚胎情况，卵裂球为6～8个，细胞大小均匀或基本均匀，无空泡，碎片≤20%判定为优质胚胎。根据患者的情况选择1～3枚胚胎进行移植，移植后14 d测定血清β-HCG，以确定生化妊娠；移植后28 d检查到宫腔内妊娠囊确诊为临床妊娠。

1.5 统计学处理

采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行分析，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

低DIF组有179个取卵周期，移植周期150个。高DIF组有29个取卵周期，移植周期25个。低DFI组的胚胎率、优质胚胎形成率和优质胚胎移植率与高DFI组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。低DFI组的受精率、正常受精率和临床妊娠率显著高于高DFI组，差异有统计学意义（P<0.01或<0.05）（表1）。

3 讨论

据调查，全世界育龄夫妇中，15%存在不育问题，其中8%～22%完全归因于男性，21%～38%与夫妇双方有关[1]。精子DNA完整性不仅会严重影响到精子的受精能力，导致受精后原核的形成，还可能导致流产、后代先天畸形或者某些遗传性疾病。对于辅助生殖技术助孕患者而言，精子DFI是影响助孕成功的不利因素之一，因此，检测精子DNA的完整性对不育患者精子质量的评估具有重要价值[2]。已有研究[3]显示，精子DNA碎片在辅助生殖技术领域中仍显示出巨大的预测价值。精液质量决定着受孕的成功率及胎儿质量，不育症患者的精子DNA损伤程度较生育男子显著增高。

有研究采用末端转移酶标记（TUNEL）技术法进行检测，结果显示，精子DFI与ART受精率之间存在负相关，提示精子顶体酶活性以及精子穿透透明带并与卵黄膜融合的能力可能会随着精子DNA碎片的增加而降低，进而影响精子的受精能力[4-5]，而使用连续顺序追踪超声检查法检测的数据则则显示无显著相关性[6]。关于胚胎质量是否受影响的争论也十分激烈，因为精子DNA损伤影响胚胎质量的机制还不甚明了，比较认同的观点是精子染色质的异常导致胚胎质量下降[6]。但是通常情况下精子DNA是在着床前胚胎发育的后期才开始表达，因此有学者认为精子DNA可能对胚胎质量影响不大[7]。

Benchaib等[8]认为，精子DNA损伤与体外受精受孕率和胚胎质量呈负相关，通过精子DNA碎片可预测IVF的成功率。Velez等[9]也发现精子DNA断裂率与受精率呈负相关，并指出其阈值为18%，胚胎质量与精子DNA损伤有关，但认为临床妊娠及分娩率与DNA损伤之间并无相关性[10]。本研究结果显示，常规IVF-ET中，DFI≥30%的受精率、正常受精率和临床妊娠率显著低于DFI<30%者，而可利用胚胎率、优质胚胎率和优质胚胎移植率比较，差异无统计学意义。有研究[11]显示，染色质异常的精子比正常精子更难以结合并穿过透明带，进入卵子后，染色质去致密化过程出现障碍，妨碍雄性原核的形成。黄茜等[12]的研究显示，精子DFI≥40%组的精子正常形态率、顶体完整率均显著降低。郑九嘉等[13]认为，精子遗传物质受到破坏后可能影响相应蛋白的转录或合成，进而影响顶体酶原的生成，或者由于无法合成某种酶原激活物质，使顶体酶无法被激活，最终表现为顶体酶活性降低，从而影响受精，因此，精子DNA损伤可能是导致受精失败的重要原因。本研究中，可利用胚胎率、优质胚胎形成率和优质胚胎移植率组间差异无统计学意义的原因可能在于通过前期的受精过程已经将有严重DNA损伤的精子进行了自然淘汰，轻微损伤的精子受精后卵母细胞可以对其DNA进行修复[14-16]；而两组临床妊娠率的差异有统计学意义提示精子DFI检测可以预测IVF-ET的妊娠结局。

综上所述，精子DNA损伤影响IVF中的受精率和正常受精率，其与胚胎质量无关，但可以预测IVF-ET的妊娠结局。其作为男性生育力评价的补充指标，有必要在行IVF-ET治疗的患者中常规开展精子DFI检查。

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（收稿日期：2015-10-15 本文编辑：祁海文）