妊娠大鼠胚胎着床后短暂抑制体内雌激素合成对分娩的影响

苑凤，武斌，贺斌，徐祥波，暴国，张树成，王介东

(1. 北京协和医学院研究生院，北京　100730；2. 国家卫生计生委科学技术研究所，北京　100081；3. 济南市中心医院，济南　250013)



·实验研究·

妊娠大鼠胚胎着床后短暂抑制体内雌激素合成对分娩的影响

苑凤1，2，武斌3，贺斌2*，徐祥波2，暴国2，张树成2，王介东2*

(1. 北京协和医学院研究生院，北京100730；2. 国家卫生计生委科学技术研究所，北京100081；3. 济南市中心医院，济南250013)

【摘要】目的研究大鼠胚胎着床后短暂抑制雌激素合成对分娩结局的影响。方法大鼠胚胎着床后GD 6.5～8.5给予雌激素抑制剂来曲唑灌胃(实验组)或溶媒灌胃(对照组)，观察其对胎儿发育和分娩结局的影响。结果实验组和对照组的窝仔数和胎(仔)鼠重量比较无统计学差异(P>0.05)；实验组孕鼠在GD 22.5均不能正常分娩，在GD 23.5体力衰竭死亡，而于GD 22.5时剖腹取出的仔鼠体重和发育正常，且可代乳存活；GD 21.5和GD 22.5时，对照组外周血孕酮水平快速下降至(6.7±4.4)nmol/L和(5.6±3.5) nmol/L，而实验组孕酮水平分别为(19.7±7.0)nmol/L和(18.0±4.2)nmol/L，显著高于对照组(P<0.05)；两组孕鼠均分别在GD 19.5、GD 20.5以及GD 20.5、GD 21.5连续2 d给予米非司酮，均分别于GD 20.5和GD 21.5启动分娩并正常生产。结论大鼠胚胎着床后给予来曲唑短暂抑制雌激素合成可导致孕鼠难产，妊娠末期给予米非司酮可以挽救难产结局。

【关键词】大鼠；芳香化酶抑制剂；来曲唑；难产；孕酮 (

(JReprodMed2016，25(2)：148-153)

雌激素和孕激素作为重要的甾体类性激素，对于大鼠妊娠起始、妊娠中胎盘功能维持、胎儿生长发育以及分娩发动都有着重要作用。大鼠妊娠时，母体对血清孕酮较大范围的波动是足以耐受的，孕酮水平升高5倍[1]或降低20%[2]对胚胎存活、胎盘及胎儿的发育几乎没有影响。研究显示灵长类动物恒河猴中，在着床期给予抗雌激素抗体，其妊娠成功率仅为1/14，而正常对照组为3/4[3]；帽猴围着床期给予他莫昔芬竞争性结合雌激素受体，可导致90%～100%的帽猴妊娠失败，而对照周期妊娠成功率为66%[4]。临床研究发现即使雌激素含量只有几个毫微克的变化也足以导致体外受精(IVF)周期的失败[5]。尽管雌激素对孕期及妊娠结局具有重要作用，但有关雌激素对妊娠影响的具体作用机理远未阐明，仅70年代有过少量研究报告，近年来相关研究缺乏。

本研究组在有关探讨雌激素对妊娠作用的前期研究中发现，在着床后即妊娠第6.5天(GD 6.5)至GD 8.5给予雌激素合成抑制剂来曲唑(0.16 mg/kg)，并不影响着床，但孕鼠在GD 22.5阴道少量出血，无法正常分娩，持续24 h之后，即GD 23.5时孕鼠因难产而体力衰竭死亡。孕早期雌激素水平的波动往往不容易被关注到，但其影响却值得关注。因此，本研究对孕鼠难产的原因进行初步探讨，以期帮助理解着床后雌激素波动在妊娠特别是分娩中的作用机制。

材料和方法

一、材料

1. 实验动物：10～11周龄Wistar雌性大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，体重约250 g。饲养环境温度20～22℃，相对湿度50%～60%，光周期调控：06∶00～18∶00光照，18∶00～06∶00黑暗，自由摄食进水。

2. 主要试剂及其配制：来曲唑片(弗隆，诺华制药，瑞士)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，购自北京化学试剂有限公司)；米非司酮(原料药，购自北京紫竹药业)。将来曲唑溶于0.5%羧甲基纤维素钠配置成0.04 mg/ml的混悬液；取1 g米非司酮溶于1 ml无水乙醇中，再加入9 ml无菌油混匀。

3. 实验仪器：Leica LMD6000 激光显微捕获仪器(徕卡公司，德国)。

二、实验方法

本研究经过实验动物伦理委员会审核，符合动物保护、动物福利和伦理原则，符合实验动物伦理的相关规定。

Wistar雌性大鼠与正常雄鼠交配，16：00将雌鼠和雄鼠按1∶1进行交配，次日9∶00检查见阴道栓者为交配成功标志，记为GD 0.5。实验组在GD 6.5、GD 7.5和GD 8.5连续3 d给予0.16 mg/kg/d来曲唑溶液灌胃；对照组同期给予相同剂量的溶媒(0.5%羧甲基纤维素钠混悬液)灌胃。

1. 胎鼠生长状况观察：实验组和对照组孕鼠在GD 15.5、GD 17.5、GD 19.5、GD 20.5、GD 21.5分别随机处死5只孕鼠，取材并称量胎鼠重量。实验组在GD 22.5随机选取5只，行剖腹产获取仔鼠，并用正常孕鼠为剖腹产仔鼠代乳，观察仔鼠生长情况至正常离乳。

2. 孕鼠孕期激素水平检测：实验组和对照组孕鼠从GD 9.5到GD 22.5，每天每组随机选取5只孕鼠，行尾静脉取血，每次取1.0 ml，室温静置40 min，3000 rpm离心5 min，取血清于-20℃冷冻保存。分别采用酶联免疫试剂盒(南京建成生物)和放射免疫法(北京北方生物)测定血清中雌二醇和孕酮的含量。

3. 米非司酮挽救孕鼠难产实验：实验组和对照组孕鼠均分别在GD 19.5、GD 20.5以及GD 20.5、GD 21.5连续2日皮下注射10 mg/kg/d米非司酮溶液(每个处理组为7只)，观察孕鼠分娩结局。

三、统计分析

结果

一、着床后短暂抑制体内雌激素合成对孕鼠分娩及胎鼠的影响

在所观察的时间点(GD 15.5、GD 17.5、GD 19.5、GD 20.5、GD 21.5和GD 22.5)，实验组和对照组孕鼠的窝仔数比较无显著性差异(P>0.05)，相同胎龄的胎/仔鼠体重亦无显著性差异(P>0.05)(表1)。

对照组孕鼠(n=5)在GD 22.5全部顺利分娩，仔鼠均为活胎且未见发育异常。实验组孕鼠(n=5)在GD 22.5阴道少量出血，但不能正常分娩，至GD 23.5全部体力衰竭死亡，未有仔鼠产出。实验组孕鼠(n=5)在GD 22.5行剖腹产后，其仔鼠均为活胎，仔鼠重量与同期自然分娩仔鼠重量比较无显著性差异(P>0.05)，经自然分娩成功后的孕鼠代乳至正常离乳，观察发现仔鼠初步表现正常，基本生命特征未见异常(表1)。

表1　着床后短暂抑制雌激素合成对大鼠胎儿体重的影响(x-±s)

注：a自主分娩产仔；b剖腹产

二、着床后短暂抑制体内雌激素合成对妊娠期激素水平的影响

对照组孕鼠尾静脉血清雌二醇浓度在GD 9.5～16.5维持在一个相对稳定水平，(310.1±30.9)pmol/L～(411.7±20.5)pmol/L；实验组在GD 6.5～8.5给予雌激素抑制剂来曲唑后，GD 9.5时的雌二醇浓度显著低于对照组[(303.8±27.9)pmol/L vs.(394.1±31.6)pmol/L](P<0.01)(图1A)，随后逐渐接近对照组，推测为药物清除半衰期内残留的来曲唑效应，显示该剂量浓度来曲唑能够抑制大鼠着床后雌二醇合成。

对照组孕鼠尾静脉血清孕酮浓度在GD 10.5出现上升[(52.8±6.0)nmol/L]，至GD 15.5达到高峰[(119.1±13.1)nmol/L]，随后开始下降，GD 17.5时下降至(78.2±16.9)nmol/L，进而在邻近分娩的GD 21.5和GD 22.5迅速下降至(6.7±4.4)nmol/L和(5.6±3.5)nmol/L。实验组与对照组相比，在GD 9.5和GD 10.5时的孕酮水平明显增高[(120.9±14.1)和(77.1±22.6)nmol/L vs.(88.1±18.5)和(52.8±6.0)nmol/L](P<0.05)，GD 15.5开始下降[(81.9±37.6)nmol/L]，至GD 17.5时下降至(29.1±8.1)nmol/L，随后呈现缓慢下降，在GD 21.5和GD 22.5并未呈现快速下降[分别为(19.7±7.0)nmol/L和(18.0±4.2)nmol/L]，与对照组相比仍维持在一个较高水平(P<0.05)(图1B)，至GD 22.5时，母鼠不能正常产仔。

注：两组间比较，*P<0.05图1　着床后(GD 6.5～8.5)给予来曲唑处理对妊娠期血清激素水平的影响

三、米非司酮挽救着床后短暂抑制雌激素合成诱发的难产现象

实验组和对照组孕鼠均分别在GD 19.5、GD 20.5及GD 20.5、GD 21.5上午9∶00连续2 d给予米非司酮处理以拮抗孕酮受体的作用。结果显示，在GD 19.5、GD 20.5给予米非司酮，实验组(n=7)与对照组(n=7)表现一致，均在GD 20.5下午自主成功分娩，胎儿及胎盘全部娩出，实验组未出现难产现象。在GD 20.5、GD 21.5给予米非司酮，实验组(n=7)与对照组(n=7)表现也完全一致，全部孕鼠均在GD 21.5下午成功分娩且胎儿及胎盘全部娩出，实验组未出现难产现象。对照组和实验组窝仔数以及仔鼠重量比较未见统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2　妊娠末期给予米非司酮挽救着床后短暂抑制雌激素合成诱发的难产(x-±s)

注：全部孕鼠均自主分娩；a在GD 19.5、GD 20.5给予米非司酮组的分娩胎龄；b在GD 20.5、GD 21.5给予米非司酮组的分娩胎龄

讨论

雌激素作为重要的甾体类性激素，是妊娠起始、妊娠维持、胎儿生长发育以及分娩发动相关的重要激素。药理剂量外源性雌激素可导致孕期大鼠胚胎死亡、胎儿发育迟缓，甚至生理剂量的外源性雌激素都可以导致胎盘迷路发育异常[6]。对于围孕期雌激素水平低下的研究，仅见早期研究报告，多采用抗雌激素抗体[3，7]和单侧卵巢切除[8-9]降低雌激素水平，或使用选择性雌激素受体调节剂降低雌激素作用[4]。来曲唑是非甾体高效选择性的第三代芳香化酶抑制剂，与雌激素生物合成限速酶——芳香化酶中的亚铁血红素可逆性结合，可显著降低雌激素水平[10]，是用来研究雌激素作用很好的药物。本研究在前期工作中[11]，发现在大鼠妊娠GD 6.5～8.5即着床后给予0.04 mg/kg、0.16 mg/kg和0.4 mg/kg来曲唑抑制雌激素合成后，吸收胎比较无显著性差异，胎/仔鼠发育正常。本研究中给予0.16 mg/kg剂量来曲唑，实验组孕鼠雌激素水平显著下降，提示为合适的研究用剂量。

本研究前期工作发现，大鼠着床后在GD 6.5～8.5给予来曲唑抑制雌激素合成后，实验组孕鼠在GD 22.5未能正常分娩出仔鼠，出现难产现象，至GD 23.5体力衰竭而死；但在GD 22.5行剖腹产后发现仔鼠存活，与对照组出生仔鼠体重比较无显著性差异；且实验组仔鼠代乳喂养至正常离乳时，生命体征未见异常，提示胚胎因素不是难产的主要原因。

分娩启动是一个复杂的调控过程。啮齿类动物包括大鼠，妊娠末期外周循环中孕酮水平的快速下降是发动分娩的重要因素[12]；在人类和高等灵长类动物以及豚鼠中，孕期及分娩启动时孕酮水平并不下降，而与子宫肌层中的孕酮受体水平有关[13-14]。我们发现在本研究孕期激素水平监测中，与对照组在GD 21.5和GD 22.5时孕酮水平的快速下降相比，实验组孕酮在GD 21.5时仍维持在较高水平，二者比较具有显著性差异，推测分娩前孕酮水平不能正常下降可能是实验组出现难产的原因之一。

因此，我们分别在GD 19.5、GD 20.5以及GD 20.5、GD 21.5连续两天给予米非司酮处理。米非司酮是孕酮受体拮抗剂，在受体水平阻断孕酮的作用，导致孕酮功能性撤退[15]。在妊娠晚期，使用米非司酮可增加宫颈胶原分解，扩张和软化宫颈，有利于宫颈成熟，也可增加前列腺素敏感性，促进宫缩，进而有利于启动分娩和缩短产程[15-18]。本研究结果显示，米非司酮拮抗孕酮受体使孕酮水平发生功能性撤退后，对照组和实验组均在第2次服用米非司酮当天下午，即GD 20.5和GD 21.5下午启动分娩并正常生产，胎儿及胎盘全部顺利娩出，未出现难产现象。妊娠末期给予米非司酮后的实验结果证实了假设，提示妊娠末期孕酮水平不能正常下降可能是大鼠着床后短暂抑制雌激素合成诱发的难产现象的主要原因之一。

此外，本研究发现实验组孕酮水平在GD 13.5～19.5期间低于对照组。研究显示妊娠时胎盘是合成雌孕激素的主要器官之一，并且雌激素可以调节孕酮的合成，妊娠中晚期给予抗雌激素Mer-25或芳香化酶抑制剂4-4-hydroxyandrostenedione，可导致孕酮水平降低，但在非孕大鼠(黄体是孕酮的主要来源)，则不影响孕酮水平[19-20]。然而，本研究中给予来曲唑处理的时间是着床后胎盘形成前(GD 6.5～8.5)，虽然并未影响着床，但很有可能已经影响蜕膜发育，进而导致胎盘形成出现异常(结果未显示)，随后胎盘中孕激素的合成与分解代谢受到影响，可能是孕酮水平在妊娠末期不能正常迅速下降的原因之一。妊娠期间甾体激素的代谢及其调节是非常复杂的，至今尚未完全解析。

综上，在本研究中妊娠大鼠胚胎着床后使用芳香化酶抑制剂来曲唑短暂抑制体内雌激素合成，可以引起孕鼠妊娠末期出现难产，妊娠末期孕酮水平不能正常快速下降可能是导致难产的主要原因之一；而妊娠末期使用米非司酮能够挽救大鼠着床后短暂抑制雌激素合成诱发的难产现象。本研究仅进行初步探讨，其中涉及相应的具体机制尚有待于进一步深入研究。

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[编辑：罗宏志]

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(本刊编辑部)

本刊论著英文摘要书写方法

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本刊编辑部

Effect of transient inhibition of estrogen production after implantation on pregnancy outcome in rat

YUANFeng1，2，WUBin3，HEBin2*，XUXiang-bo2，BAOGuo2，ZHANGShu-cheng2，WANGJie-dong2*

1.GraduatedSchool，PeckingUnionMedicalCollege，Beijing100730

2.NationalResearchInstituteforFamilyPlanning，Beijing100081

3.JinanCentralHospital，Jinan250013

【Abstract】

Objective： To determine the effect of transient inhibition of estrogen production in post-implantation period on pregnancy outcome in normal rats.

Methods： Letrozon，an aromatase inhibitor，was intragastrically administered to pregnant rats at a dose of 0.16 mg/kg/day from gestation day (GD) 6.5 to 8.5 (treated group)，or vehicle as a control (control group). Fetal development and pregnancy outcomes were examined.

Results： There was no significant difference in litter size and fetal weight between letrozole treated group and control group (P>0.05). The pregnant rat in control group normally completed parturition at GD 22.5，but the rats in letrozole treated group cannot deliver normally at GD 22.5，and ended in death with physical exhaustion at GD 23.5. When cesarean was performed at GD 22.5 in treated rats，it was found that offspring weight and development were normal，and the pups can be survived from milk replacer. The serum progesterone levels of maternal rats in control group rapidly declined to (6.7±4.4)nmol/L and (5.6±3.5)nmol/L at GD 21.5 and GD 22.5 respectively，but the progesterone levels in treated group was (19.7±7.0)nmol/L and(18.0±4.2) nmol/L respectively. There was a significant difference between the treated and control group (P<0.05). When mifepristone of 10 mg/kg/day was subcutaneously injected for two days at GD 19.5 & GD 20.5 and GD 20.5 & GD 21.5 respectively，all maternal rats in the treated and control group completed parturition at GD 20.5 and GD 21.5 respectively.

Conclusions： These results demonstrated that transient inhibition of estrogen synthesis in post-implantation period in maternal rats can result in dystocia at term. And administered mifepristone at term can rescue the dystocia.

Key words：Rat；Aromatase inhibitors；Letrozole；Dystocia；Progesterone )：主题词不多于5个。

【作者简介】苑凤，女，吉林汪清人，硕士，细胞生物学专业.(*通讯作者)

【基金项目】中央级公益性科研院所基本科研专项(2012GJSSJKA01)；十二五国家科技支撑计划项目课题(2012BAI31B06)

【收稿日期】2015-08-05；【修回日期】2015-10-15

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.2.009 搭建信息资源的桥梁