大蒜精油对桃蚜生物活性及生理生化的影响

张 强， 梁炜博， 杜雪勇， 法艳海， 王学贵*

(1.四川省资阳市雁江区农业技术推广中心， 四川 资阳 641300； 2.四川农业大学无公害农药研究室， 四川 成都 611130)

大蒜精油对桃蚜生物活性及生理生化的影响

张 强1， 梁炜博2， 杜雪勇2， 法艳海2， 王学贵2*

(1.四川省资阳市雁江区农业技术推广中心， 四川 资阳 641300； 2.四川农业大学无公害农药研究室， 四川 成都 611130)

为获得在环境中易降解无公害的植物源农药，研究大蒜精油对桃蚜的杀虫活性及生理生化的影响，测定大蒜精油对桃蚜的触杀毒力及其对试虫蛋白质含量、乙酰胆碱酯酶、中肠酯酶及海藻糖酶活性。结果表明：大蒜精油对桃蚜表现出很强的毒杀作用，其72 h触杀毒力LC50值为77.03 μg/mL；大蒜精油可诱导桃蚜中肠酯酶活性增加，海藻糖不断被分解，蛋白质的合成逐渐被遏制，对能量代谢系统破坏较大，导致能量供求失衡而死亡。大蒜精油可作为生物杀虫剂有效控制桃蚜。

大蒜精油； 桃蚜； 触杀毒力； 生理生化； 酶活性

桃蚜[Myzwspersicae(Sulzer)]是蔬菜种植中的重要害虫之一，其在蔬菜叶背或留种株的嫩梢嫩叶上危害，造成节间变短、弯曲，影响包心或结球，造成减产，同时传播病毒病[1]。近年来，随着城市化发展的加快，市场对蔬菜的需求量越来越大，大棚蔬菜栽培面积不断扩大，蚜虫在蔬菜上危害也日趋严重。运用化学药剂对蔬菜蚜虫进行防治是目前的主要措施，但是长期广泛、单一使用已导致抗性、残留等系列反应，尤其海南毒豇豆等蔬菜中毒事件屡有发生[2]。植物源农药因取材广泛，在环境中降解容易，不易产生抗药性等优点成为新农药创制研究的热点[3]。

植物精油是一类易挥发，结构简单、常具有植物特征性气味的分子构成，通常是由萜烯及生物酚类物质组成，一般由几十至几百种化合物组成[4]，是一类植物源次生代谢物质，对蔬菜品质无负面影响，既可直接用于害虫防治，又便于从中寻找天然模板进行人工合成[5]，是蔬菜害虫防治的发展方向之一。植物精油对昆虫具有驱避、熏蒸和触杀活性，是一类对环境友好的广谱性植物保护剂[6]。大蒜精油因具良好的杀虫活性而被广泛研究，如有研究表明大蒜(Alliumsativum)精油对致倦库蚊(Culexpipiensquinquefasciatus)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)幼虫具有较强的毒杀作用等[7]。

目前，随着城市化进程的加快，城市周边大棚蔬菜的种植规模越来越大，种植周期越来越短，用药频率越来越高，不仅使农药残留问题日渐凸显，并且害虫抗药性日趋严重，尤其蔬菜蚜虫由于繁殖能力强，时代重叠严重，同时也是传播病毒病的一个虫媒介体，严重影响了蔬菜的产量和品质。为降低化学农药对环境的污染，开发植物源农药势在必行。笔者对植物次生代谢物质大蒜精油对桃蚜的生物活性进行测定，并深入研究其对蛋白质含量以及中肠酯酶、海藻糖酶、乙酰胆碱酯酶活性的影响，以期为植物源农药有效控制桃蚜对十字花科蔬菜的危害和病毒病的传播提供理论。

1 材料与方法

1.1 试验虫源、试剂及仪器

供试虫源：桃蚜[Myzwspersicae(Sulzer)]，将采集的蚜虫，在24～26℃条件下连续饲养多代，挑选大小一致的无翅成蚜作为供试虫源。

药品及试剂：大蒜精油(购自广州市绿香岛天然用品有限公司)。试验中所用的溶剂及化学试剂如磷酸二氢钠、α-萘酚、α-醋酸萘酯、氯化乙酰胆碱等均为AR级(购自锐劲特生化试剂有限公司)。

仪器：CP224S型电子天平(德国赛多利斯)、HH-8型数显恒温水浴锅(金坛市易晨仪器制造有限公司)、Cryofuge 6000i GMP高速台式冷冻离心机(德国贺力氏)、UV2000分光光度计尤尼柯(上海仪器有限公司)等。

1.2 毒力测定

采用点滴法[8]。用丙酮将大蒜精油配制成1 000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L、125 mg/L和62.5 mg/L的不同浓度梯度溶液，每种溶液用微量点滴器点滴0.4 μL药液于蚜虫腹部，以30头为1组，设置3次重复，以丙酮作为空白对照。于药后24 h、48 h、72 h统计各处理的死亡情况，计算各处理的死亡率和校正死亡率以及回归方程、r值、LC50及LC50值95%的置信区间。

1.3 蚜虫生理生化指标测定及处理

用24 h的LC50浓度处理蚜虫，然后在4 h、8 h、12 h和24 h后分别测定蚜虫的蛋白质含量以及中肠酯酶、海藻糖酶、乙酰胆碱酯酶活性。并计算其增强率或抑制率[9]。

1.4 酶液的制备

中肠酯酶液的制备：挑取各处理的成蚜15头，加0.04 mol/L PBS(pH7. 0) 5 mL，冰浴下匀浆，在高速冷冻离心机上以3 500 r/ min 离心10 min，取上清液，用0. 04 mol/ L PBS 定容至10 mL作酶源，于-4℃冰箱冷藏备用。海藻糖酶液的制备：参照中肠酯酶液制备，用1.5%生理盐水代替0.04 mol/L PBS(pH7. 0)；乙酰胆碱酯酶液的制备：参照中肠酯酶液制备，用0.04 mol/ L PBS(pH7. 2) 5 mL，余同[10]。

1.5 桃蚜蛋白质含量的测定

采用紫外吸收法[11]。以0.04 mol/ L PBS(pH7. 0)为空白管调节零点，分别在紫外分光光度计280 nm和260 nm波长下测定酶提取液光密度，利用Lowry-Kalokar公式进行计算蛋白质含量：

蛋白质浓度 (mg/mL)=1.45OD280-0.74OD260。

1.6 桃蚜生物酶活力的测定

1.6.1 肠酯酶活力 在具塞刻度试管内加入5 mL底物溶液(3×10-4mol/Lα-醋酸萘脂溶液)，再加入酶液1 mL摇匀后置于25 ℃下温育30 min，加入显色液1 mL摇匀，终止反应并显色，待出现稳定的蓝绿色，在分光光度计上测定OD600值。对照以1 mL缓冲液代替酶液，其余处理相同。酶比活力以1 min内OD值增加0.01为1个酶活力单位，并以单位/15头蚜虫表示[12]。

1.6.2 桃蚜海藻糖酶活力 取2%海藻糖溶液24 mL于小三角瓶中，加入酶液6 mL，摇匀置于37℃下温育30 min后，置于沸水中煮2～3 min终止反应，将反应液用滤纸过滤后测定其中的还原性葡萄糖。测定方法采用陈长坤的测定方法[13]。酶比活力以1 min内水解出还原性糖量增加1 mg为1个酶活力单位，并以单位/头蚜虫表示。

1.6.3 桃蚜乙酰胆碱酯酶 在具塞试管内加入氯化乙酰胆碱1 mL，再加入酶液1 mL，迅速摇匀计时，并置于37 ℃下温水浴40 min，而后立即依次加入2 mol/L盐酸羟胺和3.5 mol/L氢氧化钠混合液(按1∶1比例临时混合)2 mL、1∶2盐酸溶液(盐酸与水体积比)1 mL、0.37 mol/L三氯化铁溶液1mL，用分光光度计测定540 nm处的OD540值。对照以0.5 mL缓冲液代替酶液，且在加入盐酸羟胺和氢氧化钠混合液之前加1∶2盐酸溶液，其余处理相同。酶比活力以1 min内OD值增加0.01为1个酶活力单位，并以单位/15头蚜虫表示[8]。

2 结果与分析

2.1 大蒜精油对桃蚜的触杀毒力

由表1可知，大蒜精油对桃蚜成虫表现出较强的触杀活性，其24 h、48 h及72 h的触杀活性LC50值分别为270.99 μg/mL、112.97 μg/mL和77.03 μg/mL。

表1 大蒜精油对桃蚜的触杀毒力

Table 1 Contact toxicity of garlic essential oil toM.persicae

处理时间/hTreatmenttime回归方程(y=a+bx)Regressionequationab相关系数rCorrelationcoefficientLC50值/(μg/mL)LC50valueLC50值95%置信区间95%confidenceintervalsofLC50value242．79330．90700．9907270．99149．27～491．97481．87281．52330．9805112．9775．85～168．23721．66551．76730．995477．0350．29～118．01

2.2 大蒜精油对桃蚜生理生化的影响

2.2.1 大蒜精油处理桃蚜的蛋白质含量及海藻糖酶活力 由表2可知，当虫体接触大蒜精油后其蛋白质含量先增加后降低，在处理后8 h，供试桃蚜蛋白含量增加2.270 3 mg/15头；处理12 h后蛋白质

表2 大蒜精油处理桃蚜后蛋白质含量及海藻糖的酶活力

注：①蛋白质含量为3次重复的平均值±标准误，②1min内水解出还原性糖的量增加1mg为1个酶活力单位。

Note: ①, Mean ± SE; ②, increased 1 mg reducing sugar by hydrolyzing in a minute is used as one enzyme active unit.

含量受到抑制，抑制率达16.96%；在处理24 h，其蛋白质含量达1.791 2 mg/15头，抑制率为10.05%，后逐渐趋于正常水平。海藻糖酶活性先增高，其4 h时的酶比活力增强率达81.75%，8 h降低到对照水平(-1.12%)，后又逐渐上升到24 h的76.87%。

2.2.2 大蒜精油处理桃蚜的中肠酯酶和乙酰胆碱酯酶活力 由表3可知，大蒜精油作用虫体后，迅速抑制中肠酯酶活性，药后4 h的抑制率达41.97%，但在药后8 h、12 h及24 h的酶活力分别较对照增强26.18%、27.27%和95.97%，说明大蒜精油作用虫体后，先迅速抑制中肠酯酶活性，但虫体在精油作用下酶活迅速增强适应逆境，加快对大蒜精油的解毒代谢；而大蒜精油作用桃蚜后4 h，乙酰胆碱酯酶活性略高于对照，说明桃蚜受到大蒜精油的刺激表现出兴奋状，但其活性逐渐降低，在8 h、12 h及24 h酶活力抑制率分别为1.4%、2.58%和3.1%。

表3 大蒜精油处理桃蚜后的中肠酯酶和乙酰胆碱酯酶活力

注：①和②均表示 1 min内OD值增加0.01为1个酶活力单位。

Note: ①and ② both indicate that the increased 0.01 OD value in a minute is used as one enzyme active unit.

3 结论与讨论

1) 测定大蒜精油对桃蚜的毒力及其生理生化的影响结果表明，大蒜精油对桃蚜具有较强的毒力，且经大蒜精油LC50浓度处理的试虫表现出短期内酶活性被抑制，随作用时间延长而被迅速诱导激活，海藻糖不断被分解，蛋白质的合成被遏制，破坏能量代谢供求失衡，最终导致死亡。

2) 昆虫的生命活动和行为受内部各系统的相互联系和协调机制所控制。蛋白质是生物体最重要的特征，它存在于所有生活的细胞中，如酶在细胞代谢过程中控制着很多化学反应。因此，蛋白质及中肠酯酶、海藻糖酶等都是昆虫能量代谢中的重要因子，它们之间一定存在着某些协调关系[12]。试验表明，大蒜精油对桃蚜蛋白质的合成有遏制作用，干扰其蛋白质的正常代谢，12 h抑制率达16.96%；海藻糖酶活性则先增强，4 h时其酶比活力增强率达81.75%，说明桃蚜最初受大蒜精油刺激而兴奋，能量消耗大，以满足能量需求虫体体内储藏的海藻糖被加速分解；而在处理8 h后降低到对照水平，之后逐渐上升，可能为桃蚜消化系统受到破坏，能量供应不足，只能利用虫体自身储存的海藻糖等能源，海藻糖不断被分解，所以海藻糖酶比活力在8 h后又逐渐升高，直到桃蚜死亡。

3) 大蒜精油处理桃蚜后，其乙酰胆碱酯酶活性受刺激后略微升高后逐渐降低，但相对于空白对照变化较小，可能大蒜精油对桃蚜乙酰胆碱酯酶活性的影响较小。而昆虫中肠酯酶是消化酶中很重要的一类酶，几乎在所有的生物中都存在，其在生物不同组织、不同发育时期的表达量也有差异，当有外源有毒物质进入生物体后，可被诱导增强活性，从而增强对外源有毒物质的代谢能力而保护自身体机[14]。在该试验中，中肠酯酶在4 h时活性受到抑制，抑制率为41.97%，虫体靠蛋白质、海藻糖等提供能量，与蛋白质、海藻糖酶的变化一致。本试验中，桃蚜中肠酯酶活性在经大蒜精油LC50浓度处理8 h后，其酶活性不断升高，在24 h酶比活力增强率达95.97%，说明大蒜精油对桃蚜有较强的生物活性，已诱导激发供试昆虫的解毒酶活性。

目前，关于昆虫酯酶与昆虫抗药性的研究越来越多，并已深入到分子水平。一般认为是编码酯酶基因的过量表达使酯酶解毒酶量增加或活性提高，从而使对杀虫药剂产生抗药性，在棉铃虫细胞色素P450方面已经有相关研究报道[15]。当然，大蒜精油诱导编码桃蚜中肠酯酶基因的表达增加导致解毒能力增强等，从分子水平明确其机理仍需深入研究。

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(责任编辑： 孙小岚)

Effects of Garlic Essential Oil on Biological Activity, Physiology and Biochemistry ofMyzwspersicae

ZHANG Qiang1, LIANG Weibo2, DU Xueyong2, FA Yanhai2, WANG Xuegui2*

(1.YanjiangAgricultureTechnologyandPopularizingCenter,Ziyang,Sichuan641300; 2.LaboroatoryofPollution-freePesticide,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

The effects of garlic essential oil on contact toxicity, protein content, acetylcholinesterase activity, midgut esterase activity and trehalase activity ofM.persicaewere determined to study the effects of garlic essential oil on insecticidal activity, physiology and biochemistry ofM.persicaand to obtain botanical pesticides with easily degradable and pollution-free in environment. Results; Garlic essential oil has the strong toxic effect onM.persicae. LC50value of the contact toxicity after 72 h is 77.03 mg/mL. Garlic essential oil can increase midgut esterase activity, decompose mycose continuously, inhibit protein synthesis gradually and destroy the energy metabolism system greatly inM.persicae, which results in death ofM.persicaebecause of the imbalance between energy supply and demand inM.persicae. In conclusion, garlic essential oil can be used as the biological insecticide to controlM.persicaeeffectively.

garlic essential oil;Myzwspersicae; contact toxicity; physiology and biochemistry, enzyme activity

2015-07-20； 2016-01-09修回

中央高校特别资助项目“大蒜精油对大棚蔬菜蚜虫防控效果及机理研究”(2011JS080)

张 强(1984-)，男，助理农艺师，从事农技推广工作。E-mail: 306233332@qq.com

*通讯作者:王学贵(1976-)，男，副教授，从事农药学的教学与科研工作。E-mail:25202310@qq.com

1001-3601(2016)01-0019-0068-04

S433.3

A