膀胱尿路上皮癌标本中人微小核糖核酸3658与人源性长寿保障基因Ⅱ型基因表达的相关性及其临床意义

梁 敏，王海峰，王剑松，杨 宏



·论著·

膀胱尿路上皮癌标本中人微小核糖核酸3658与人源性长寿保障基因Ⅱ型基因表达的相关性及其临床意义

梁 敏，王海峰，王剑松，杨 宏

【摘要】目的探讨人微小核糖核酸3658(miR-3658)和人源性长寿保障基因Ⅱ型(LASS2)在临床膀胱尿路上皮癌标本中的表达差异及相关性。方法收集昆明医科大学第二附属医院和云南省肿瘤医院泌尿外科2014年1月—2015年1月收治的膀胱癌患者96例，在膀胱癌根治术中获取膀胱癌组织和癌旁组织。采用实时荧光定量PCR测定膀胱癌组织和癌旁组织miR-3658及LASS2 mRNA表达水平；采用免疫组化法检测膀胱癌组织和癌旁组织LASS2蛋白表达情况。结果膀胱癌组织miR-3658 mRNA表达水平高于癌旁组织，LASS2 mRNA表达水平低于癌旁组织，差异均有统计学意义(t=6.46、38.12，P<0.01)。不同复发性、病理分级、浸润深度、淋巴转移、远处转移、TNM分期者miR-3658、LASS2 mRNA表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。LASS2蛋白表达定位于胞质中，呈棕色或黄褐色颗粒状。膀胱癌组织LASS2蛋白阳性表达率低于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=15.32，P<0.01)。不同复发性、病理分级、浸润深度、淋巴转移、TNM分期者LASS2蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示，膀胱癌组织LASS2 mRNA表达水平与miR-3658 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.676，P<0.05)。结论miR-3658与LASS2在膀胱癌组织中的表达呈负相关，miR-3658可能通过调节LASS2表达而参与膀胱癌发生发展的过程。

本研究背景：

膀胱癌由于高复发率和高转移能力而预后不良，如何防止肿瘤复发及抑制疾病的进展是该病治疗面临的挑战。寻求新的有效的生物预后标志物和治疗靶标，探索更有效的个性化治疗策略是关键。为此，探讨膀胱癌组织中人微小核糖核酸(miRNA)和相关基因的异常表达及与临床病理特征间的关系是重要的第一步。膀胱癌在恶性肿瘤中占1%～2%，其中90%以上为膀胱尿路上皮癌[1]。人微小核糖核酸(miRNA)通过调控基因表达，参与到肿瘤细胞的多项生物学行为已得到广泛证实[2]。有研究发现，人源性长寿保障基因Ⅱ型(homo sapiens longevity assurance homologue 2，LASS2)在不同膀胱癌组织中存在表达差异[3]。本研究预实验通过基因芯片及生物信息学预测技术，筛选出不同组织标本(包括膀胱癌组织、癌旁正常组织、LASS2高表达的膀胱癌组织、LASS2低表达的膀胱癌组织)中差异表达而且与LASS2存在相互作用且最相关的miRNA为miR-3658，推测miR-3658可能与靶向LASS2的3′末端非翻译区(3′ untranslated regions，3′ UTR)结合，参与到膀胱癌调控机制。因此，本研究对临床膀胱尿路上皮癌标本中miR-3658和LASS2的表达水平进行了初步研究。

1材料与方法

1.1材料和组织收集昆明医科大学第二附属医院和云南省肿瘤医院泌尿外科2014年1月—2015年1月收治的膀胱癌患者96例，其中男74例，女22例；年龄32～67岁，平均年龄(47.6±9.4)岁；肿瘤分期：T1期12例，T2期49例，T3期30例，T4期5例，术后病理均证实为膀胱尿路上皮癌。膀胱癌组织及癌旁组织均在膀胱癌根治性手术中获得，收集新鲜膀胱癌组织立即置于-80 ℃液氮中，保存直至RNA提取。相应的癌旁组织为至少远离癌组织2 cm以上的正常膀胱组织，采用相同的方法保存用作对照。

1.2仪器与试剂RM2135石蜡切片机和300型染色机(美国Leica公司)，小鼠抗人LASS2蛋白多克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司15596-026)，即用型DAB免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥生物公司)，miRcute miRNA提取分离试剂盒(北京天根生化)，miRNA反转录试剂盒(大连宝生物)，miRNA荧光定量检测试剂盒(大连宝生物)，Quant反转录试剂盒(北京天根生化)，普通荧光定量检测试剂盒(美国KAPA bio公司)。

1.3实验方法

1.3.1总RNA提取(Trizol法提取)标本总RNA提取，按照invitrogen公司的操作说明进行。RNA用普通琼脂糖凝胶电泳检测完整性，电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150 V 15 min。紫外分光光度法检测OD260/OD280，确定其纯度及浓度进行质量控制。

1.3.2反转录合成cDNA第一链(for mRNA)按照反转录试剂盒操作说明将提取的RNA进行反转录，合成用于mRNA检测的cDNA第一链。反应体系：5×RT Buffer，2 μl，RT Enzyme Mix 0.5 μl，Primer Mix 0.5 μl，RNA 0.5 pg～1.0 μg，加无核酸酶水(Nuclease-free Water)至总体积10 μl，合成的cDNA于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3Poly(A)加尾反应和反转录(for miRNA)按照miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明，在miRNA 3′末端加多聚A尾Poly(A)，再进行反转录反应，最终生成miRNA对应的cDNA第一链。反应体系：Poly(A)反应液2 μl，10×RT Primer 2 μl，10×RT Buffer 2 μl，Super Pure dNTPs(2.5 mmol/L each)1 μl，RNasin(40 U/μl)1 μl，Quant RTase 0.5 μl，无RNA酶的双蒸水(RNase-Free ddH2O)11.5 μl。37 ℃反应60 min。

1.3.4实时荧光定量PCR反应(for mRNA)选用GAPDH作为内参基因，引物序列为GAPDH-F：5′-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3′，GAPDH-R：5′-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3′，LASS2-F：5′-TCTCCTGGTTTGCCAATTACG-3′，LASS2-R：5′-CCGGGCAGGGACCCTCATCA-3′。反应体系：RNase-free ddH2O 7 μl，KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2×)10 μl，正向引物(10 μmol/L)0.4 μl，反向引物(10 μmol/L)0.4 μl，模板cDNA 1.8 μl，ROX染料0.4 μl。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性3 s，60 ℃退火30 s，循环30次。实时定量分析采用2-△△Ct法。

1.3.5实时荧光定量PCR反应(for miRNA)选用U6作为内参基因，引物序列为U6-F：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，miR-3658-F：5′-GTGGGGGTTTAAGAAAACACCAT-3′，miR-3658-R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，miR-3658 stem loop：5′-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAG-CCAAC ATCTCC-3′，下游通用引物：试剂盒自带。反应体系：SYBR Premix EX Taq Ⅱ(2×)10 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μl，Uni-miR qPCR Primer(10 μmol/L)0.8 μl，模板cDNA 2 μl，RNase-free ddH2O 6.4 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，循环40次。实时定量分析采用2-△△Ct法，ΔCt=Ct(miR-3658)-Ct(U6)，所有标本重复3孔。

1.3.6免疫组化检测LASS2表达及细胞定位参照即用型快捷免疫组化MaxVisionTM2试剂盒(鼠)说明书(编号：40462a)进行免疫组化操作。LASS2阳性结果判定：每张组织切片随机进行10个高倍视野的观察(HPEs×200)，计数100个肿瘤样细胞。以胞膜或胞质出现棕褐色的染色细胞为阳性。染色<25%，细胞无染色或者弱染色及中等程度染色记(-)；染色25%～50%，细胞中等至强染色记(+)；染色>50%，强染色记(++)。

2结果

2.1膀胱癌组织和癌旁组织miR-3658、LASS2mRNA表达水平比较膀胱癌组织miR-3658表达水平为(4.15±2.78)，LASS2表达水平为(11.83±3.62)；癌旁组织miR-3658表达水平为(2.17±1.14)，LASS2表达水平为(28.21±2.15)。膀胱癌组织miR-3658表达水平高于癌旁组织，LASS2表达水平低于癌旁组织，差异均有统计学意义(t=6.46、38.12，P<0.01)。

2.2不同临床特征者miR-3658、LASS2mRNA表达水平比较不同复发性、病理分级、浸润深度、淋巴转移、远处转移、TNM分期者miR-3658、LASS2mRNA表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同性别、年龄、肿瘤大小、多发性者miR-3658、LASS2mRNA表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.3LASS2免疫组化LASS2蛋白表达定位于胞质中，呈棕色或黄褐色颗粒状(见图1，本文彩图详见本刊官网www.chinagp.net)。膀胱癌组织LASS2蛋白阳性表达率低于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=15.32，P<0.01，见表2)。

Table1　ComparisonofmiR-3658andLASS2mRNAexpressionofpatientswithdifferentclinicfeatures

临床特征例数miR-3658mRNA水平 t值 P值LASS2mRNA水平 t值 P值临床特征例数miR-3658mRNA水平 t值 P值LASS2mRNA水平 t值 P值性别0.5160.1820.6210.121病理分级31.39<0.0107.024<0.010 男742.61±1.217.89±3.57 高分化491.19±0.3211.06±1.12 女222.53±0.928.26±4.62 低分化474.10±0.857.93±4.22年龄(岁)1.5543.4050.9600.268浸润深度7.7760.0088.190<0.010 ≥50363.12±0.289.72±3.23 T1+T2612.14±2.039.62±2.22 <50603.76±1.829.17±5.44 T3+T4353.98±1.126.12±3.55肿瘤大小(cm)0.5651.2381.3510.083淋巴转移18.240.03213.07<0.050 ≥3532.82±0.279.72±3.25 无642.14±0.7710.82±1.67 <3432.62±1.568.93±4.72 有323.98±0.625.98±3.22原发/复发12.000<0.0505.470<0.050远处转移15.940.0137.6550.009 原发631.48±0.5610.18±3.24 无862.03±0.8410.20±1.78 复发333.93±1.927.63±3.22 有103.83±0.728.73±0.61单发/多发1.3210.6232.0610.168TNM分期(期)24.90<0.0506.7570.011 单发423.27±1.929.62±3.22 Ⅰ+Ⅱ551.63±0.665.26±1.62 多发543.55±0.798.85±1.74 Ⅲ+Ⅳ414.02±0.677.82±3.34

表2膀胱癌组织和癌旁组织LASS2蛋白阳性表达情况比较

〔n(%)〕

Table 2Comparison of LASS2 protein positive expression between bladder cancer tissues and paracarcinoma tissues

组织例数LASS2蛋白表达阳性 阴性膀胱癌组织9639(40.6)57(59.4)癌旁组织9666(68.8)30(31.2)

2.4不同临床特征者LASS2蛋白阳性表达率比较不同复发性、病理分级、浸润深度、淋巴转移、TNM分期者LASS2蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；而不同性别、年龄、肿瘤大小、多发性、远处转移者LASS2蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表3)。

注：A为(-)(×100)，B为(+)(×100)，C为(++)(×100)，D为(-)(×200)，E为(+)(×200)，F为(++)(×200)

图1　LASS2蛋白表达情况

2.5miR-3658和LASS2 mRNA表达水平在膀胱癌组织中的相关性Pearson相关分析结果显示，LASS2 mRNA表达水平与miR-3658 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.676，P<0.05)。

3讨论

LASS2基因也称肿瘤转移抑制因子1(tumor metastasis suppressor gene 1，TMSG1)，与多种癌症的浸润、转移有密切关系，包括前列腺癌、肝癌、乳腺癌、脑膜癌等[4-7]。在本实验中，分别采用实时定量PCR和免疫组化法检测LASS2的表达，结果显示膀胱癌组织LASS2 mRNA表达水平低于癌旁组织，其表达水平与癌细胞病理分级、肿瘤浸润深度、淋巴转移、肿瘤TNM分期以及肿瘤复发特征相关；膀胱癌临床分期越晚、肿瘤细胞恶性程度越高、侵袭能力越强，LASS2 mRNA表达水平越低。

在膀胱癌方面，目前关于LASS2的研究较少。有学者发现增殖和侵袭能力较高的EJ-M3和BIU-87的LASS2表达水平最低，而另外两株低转移的膀胱癌细胞中LASS2的表达相对较高[8-9]，并且发现LASS2基因与临床分期、浸润深度、复发性紧密相关，LASS2表达阴性的膀胱癌患者具有较差的预后[3]，与本实验结果基本一致。因此推测LASS2参与了膀胱癌细胞增殖和浸润过程中的信号通路，从而影响了膀胱癌细胞株的增殖浸润能力，具体可能与胞质内神经酰胺以及囊泡型ATP酶(vacuolar ATPase，V-ATPase)的表达调节作用相关。本实验结果证实，LASS2蛋白表达定位于胞质中，而该蛋白的TLC结构域影响二氢神经酰胺的合成，而后者作为细胞信号传递的第二信使，影响细胞凋亡和细胞周期的调控，从而抑制癌细胞的增殖浸润过程。同时，LASS2基因的表达与V-ATPase相互作用，降低质子泵跨膜运输H+的能力，通过影响细胞内外的酸碱度，实现抑制癌细胞增殖生长以及浸润转移功能[10-12]。

miRNA是一类非编码单链微小RNA，其可能通过参与调控基因表达而参与癌症的发生、发展。本实验检测miR-3658的表达水平，发现膀胱癌组织miR-3658 mRNA表达水平高于癌旁组织，其表达水平与膀胱癌浸润深度、淋巴转移、远处转移、病理分级、TNM分期及复发性等相关；膀胱癌临床分期越晚、肿瘤细胞恶性程度越高、侵袭能力越强、远处转移，miR-3658 mRNA表达水平越高。Hao等[13]发现miR-3658在多发性骨髓瘤患者血清中的表达水平较正常人显著升高。与本实验比较，虽然肿瘤的种类不同，但是结果相一致。进一步分析发现，miR-3658与LASS2 mRNA表达水平均与远处转移相关，肿瘤远处转移时，LASS2 mRNA表达水平降低，而miR-3658 mRNA表达水平增高。目前研究发现，癌症的远处转移与上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)具有紧密相关性。而在癌症的远处转移过程中，一些miRNAs能够调控EMT相关的靶基因，影响肿瘤的转移。因此猜测miR-3658在膀胱癌的发生发展以及转移中可能起到一定的作用。

本研究结果亦表明，miR-3658及LASS2在膀胱癌组织中均呈差异性表达，而且，两者的表达水平呈显著负相关。特别的是，miR-3658及LASS2差异性表达相关的临床病理参数较为一致，均为膀胱癌的浸润深度、淋巴转移、远处转移、病理分级、肿瘤TNM分期及复发性肿瘤。原癌基因和抑癌基因的激活方式主要有基因突变、基因插入、基因扩增、染色体易位等。由于miRNAs分子量较小，比较容易受到上述影响从而改变其在细胞内的表达水平，调控靶基因表达，可能改变细胞的癌变进程。基于此，miR-3658可能通过参与到LASS2某种信号通路，在膀胱癌的发生发展中起到一定作用。但由于本实验仅限于miR-3658和LASS2基因在组织中的表达水平变化的分析，所以不能提供充分的证据去验证这个观点，相关的研究工作还有待深入进行。

作者贡献：梁敏进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；王海峰进行实验设计、分析数据、质量控制及审校，并对文章负责；王剑松指导实验设计和实施；杨宏进行实验实施、评估、资料收集。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：贾萌萌)

【关键词】膀胱肿瘤；微小核糖核酸；人源性长寿保障基因Ⅱ型；相关性

梁敏，王海峰，王剑松，等.膀胱尿路上皮癌标本中人微小核糖核酸3658与人源性长寿保障基因Ⅱ型基因表达的相关性及其临床意义[J].中国全科医学，2016，19(5)：549-553，559.[www.chinagp.net]

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Correlation of miR-3658 and Homo Sapiens Longevity Assurance Homologue 2 Expression in Bladder Urothelial Carcinoma Samples and Its Clinical SignificanceLIANGMin，WANGHai-feng，WANGJian-song，etal.DepartmentofUrology，the5thAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Gejiu661000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression differences and correlation of microRNA-3658(miR-3658)and homo sapiens longevity assurance homologue 2(LASS2)in clinical bladder urothelial carcinoma samples.MethodsWe collected 96 patients with bladder urothelial carcinoma from the Departments of Urology in the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University and Yunnan Cancer Hospital from January 2014 to January 2015；bladder cancer tissues and paracarcinoma tissues were obtained from radical resection of bladder urothelial carcinoma.Hsa-miR-3658 and LASS2 mRNA expression in bladder cancer tissues and paracarcinoma tissues were detected by real-time fluorescence quantification PCR；LASS2 protein expression in bladder cancer tissues and paracarcinoma tissues was detected by immunohistochemistry(IHC).ResultsmiR-3658 mRNA expression was higher in bladder cancer tissues than paracarcinoma tissues；and LASS2 mRNA expression was lower in bladder cancer tissues than paracarcinoma tissues；the two differences were both significant(t=6.46，38.12；P<0.01).miR-3658 mRNA and LASS2 mRNA expression were significantly different among patients with different recurrence status，pathological grade，infiltration depth，lymphatic metastasis，distal metastasis and TNM stages(P<0.05).LASS2 protein located in cytoplasm was brown or yellow-brown granules.The positive expression rate of LASS2 protein was lower in bladder cancer tissues than paracarcinoma tissues(χ2=15.32，P<0.01).The positive expression rate of LASS2 protein was significantly different among patients with different recurrence status，pathological grades，infiltration depth，lymphatic metastasis and TNM stages(P<0.05).Pearson correlation analysis results showed LASS2 mRNA and miR-3658 mRNA expression were negatively correlated in bladder cancer tissues(r=-0.676，P<0.05).ConclusionmiR-3658 expression is negatively correlated with LASS2 expression in bladder cancer tissues，and miR-3658 may participate in the occurrence and development of bladder cancer by regulating the LASS2 expression.

【Key words】Urinary bladder neoplasms；MicroRNA；LASS2；Correlation

(收稿日期：2015-09-24；修回日期：2015-12-01)

【中图分类号】R 737.14

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.05.013

通信作者：王海峰，650101云南省昆明市，昆明医科大学第二附属医院泌尿外科，云南省泌尿外科研究所；E-mail：highphone@126.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81260374；81460384)；云南省教育厅基金资助项目(2014Z072)；云南省科技厅面上项目(2015FB196)；云南省科技厅-昆明医科大学联合专项(2014FA015；2014FZ031)；云南省卫生厅内设机构项目(2014NS081)
作者单位：661000云南省个旧市，昆明医科大学第五附属医院 红河州滇南中心医院泌尿外科(梁敏)；昆明医科大学第二附属医院泌尿外科，云南省泌尿外科研究所(梁敏，王海峰，王剑松)；昆明医科大学第三附属医院，云南省肿瘤医院泌尿外科(杨宏)