心肌缺血再灌注后CXC趋化因子配体16水平的变化及调节机制

曾 敏，魏 欣，李 伟，蒙绪卿，符秀虹，陈积雄，王 萍



·论著·

心肌缺血再灌注后CXC趋化因子配体16水平的变化及调节机制

曾 敏，魏 欣，李 伟，蒙绪卿，符秀虹，陈积雄，王 萍

【摘要】目的探讨心肌缺血再灌注后CXC趋化因子配体16(CXCL16)水平的变化及调节机制。方法将30只新西兰大白兔，按照随机数字表法分为假手术组、心肌缺血再灌注组和四氢吡咯二硫代氨基甲酯(PDTC)组。PDTC组经耳缘静脉注射20 mg/kg PDTC，30 min后PDTC组和心肌缺血再灌注组结扎冠状动脉，1.5 h后松解缝合线，假手术组只穿线不结扎。再灌注1 h后从左心房注入硫磺素S，无复流区无荧光着色；于原位重新结扎左回旋支，从左心房再次注入伊文斯蓝，非蓝染区域为缺血区。处死动物，沿平行房室沟方向将心室切片，手动描记心肌切片左心室壁、缺血区、无复流区轮廓。于动物结扎时和结扎后45、100、150 min时采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管自耳缘静脉采血5 ml，应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定CXCL16水平。取左心室室间隔区、缺血区、无复流区心肌组织染色,以细胞核染阳性率反映心肌NF-κB p65表达水平。结果PDTC组心肌缺血范围和无复流范围均小于心肌缺血再灌注组，差异有统计学意义(P<0.05)。不同干预措施对动物结扎后不同时间CXCL16水平的影响，差异有统计学意义(P<0.05)。心肌缺血再灌注组结扎后100 min CXCL16水平高于结扎时和结扎后45 min,差异有统计学意义(P<0.05)。各组缺血区和无复流区细胞核染阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中，心肌缺血再灌注组缺血区和无复流区细胞核染阳性率高于假手术组和PDTC组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论心肌缺血再灌注可诱导CXCL16的表达；抑制NF-κB的激活可降低CXCL16的水平，缩小心肌缺血范围和无复流范围。

CXC趋化因子配体16(CXCL16)是近年来新发现的CXC趋化因子家族穿膜细胞因子，以跨膜蛋白和可溶性蛋白两种形式存在。有证据显示，CXCL16与肠道炎症、肾小球肾炎等疾病的发生及其严重程度密切相关[1-2]，对冠心病的炎症效应也日渐受到关注[3]。本研究旨在观察心肌缺血再灌注不同时间窗内CXCL16水平的变化，并通过NF-κB活性与CXCL16的关系来探讨细胞因子在信号转导途径上的调节机制。

1材料与方法

1.1动物与试剂健康雄性清洁级新西兰大白兔30只，月龄4～6个月，体质量2.0～3.0 kg,购自北京海淀兴旺动物养殖公司。四氢吡咯二硫代氨基甲酯(PDTC)、硫磺素S购自美国Sigma公司；CXCL16 ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司；小鼠抗兔NF-κB p65单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；伊文斯蓝购自美国Alfa Aesar公司。

1.2方法

1.2.1心肌缺血再灌注模型按随机数字表法将动物分为假手术组、心肌缺血再灌注组(I/R组)和PDTC组，每组各10只。PDTC组经耳缘静脉注射20 mg/kg PDTC，假手术组和I/R组给予相同剂量的0.9%氯化钠溶液。30 min后采用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉注射麻醉动物,气管插管后接小动物呼吸机(呼吸频率32次/min，吸呼比1∶2，潮气量15 ml/kg)进行机械通气。于胸骨正中打开胸腔，纵行切开心包膜，暴露心脏，并将心包膜缝合于胸壁呈吊篮状，于冠状动脉左回旋支近段1/5处穿入3/0缝合线，再将缝合线穿入阻断管，结扎冠状动脉，心肌缺血依据心电图ST段抬高且有节段性运动不良确认。I/R组和PDTC组结扎1.5 h后松解缝合线再灌注。假手术组只穿线不结扎。

1.2.2心肌缺血及无复流范围再灌注1 h后从左心房注入1.5 ml/kg 6%硫磺素S，无复流区无荧光着色；于原位重新结扎左回旋支，从左心房再次注入2 ml 4%伊文斯蓝，非蓝染区域为缺血区。处死动物，迅速取出心脏,用冰冷的0.9%氯化钠溶液冲洗心脏，沿平行房室沟方向将心室切为6～8片心肌短轴切片(6 μm,Leica 2323型石蜡切片机)。对切片进行拍照并保存图像，按染色结果对各个区域分别取材，液氮保存。用Image Pro Plus 6.0图像分析软件打开图像,分别手动描记心肌切片左心室壁、缺血区、无复流区轮廓,确定左心室壁面积(LV)、缺血面积(RA)、无复流面积(NRA),并计算缺血范围=RA/LV×100%，无复流范围=NRA/LV×100%。

1.2.3CXCL16的测定于动物结扎时和结扎后45、100、150 min时采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管自耳缘静脉采血5 ml，以1 000 r/min离心15 min,离心半径10 cm,取血浆于-80 ℃低温冻存。采用CXCL16 ELISA检测试剂盒,应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定CXCL16水平,经彻底洗涤后用底物TMB显色。采用酶标仪在波长450 nm处测定吸光度值(OD值)。

1.2.4心肌不同区域NF-κB p65表达水平取左心室室间隔区、缺血区、无复流区心肌组织，10%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,切片。将石蜡切片脱蜡,抗原修复后滴加小鼠抗兔NF-κB p65单克隆抗体(1∶75),左心室室间隔区使用PBS代替一抗,37 ℃湿盒孵育,4 ℃过夜,次日滴加特异性生物素化二抗及过氧化物酶复合物,DAB显色,苏木精复染,中性树胶封片。每只动物选取连续3张切片,分别以左心室室间隔区、缺血区、无复流区为目标区域,每张切片随机选取10个视野,200倍及400倍光镜下拍照并保存图像，Image Pro Plus 6.0图像分析软件分析图片,以细胞核染阳性率反映心肌NF-κB p65表达水平,细胞核染阳性率=细胞核染色阳性的细胞数/视野内总细胞数×100%。

2结果

2.1I/R组和PDTC组心肌缺血范围和无复流范围比较PDTC组心肌缺血范围和无复流范围均小于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table1Comparisonofischemicareaandno-reflowareabetweencardiacI/RgroupandPDTCgroup

组别只数心肌缺血范围无复流范围I/R组1055.541±4.25369.743±6.384PDTC组1026.482±2.78135.643±3.201t值3.1722.919P值0.0180.023

2.2各组CXCL16水平比较不同干预措施对动物结扎后不同时间CXCL16水平的影响，差异有统计学意义(P<0.05)。I/R组结扎后100 min CXCL16水平高于结扎时和结扎后45 min,差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

Table2ComparisonofCXCL16levelamongthethreegroupsatdifferenttimepoints

组别只数结扎时结扎后45min结扎后100min结扎后150min假手术组101.591±0.0621.893±0.0711.513±0.0821.692±0.094I/R组101.753±0.0942.342±0.0943.030±0.264ab2.321±0.180PDTC组101.671±0.1711.791±0.0541.941±0.1401.743±0.142F值F交互=4.690,F时间=7.320,F组间=10.210P值P交互=0.162,P时间=0.089,P组间=0.032

注：与组内结扎时比较，aP<0.05；与组内结扎后45 min比较，bP<0.05

2.3细胞核染阳性率各组室间隔区细胞核染阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。各组缺血区和无复流区细胞核染阳性率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中，I/R组缺血区和无复流区细胞核染阳性率高于假手术组和PDTC组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

Table3Comparisonofpositivedyeingrateofmyocardialcellnucleusamongthethreegroups

组别只数室间隔区缺血区无复流区假手术组107.081±1.0907.232±1.1207.170±0.911I/R组108.764±1.88168.411±9.352ab35.324±6.060abPDTC组105.892±1.1216.022±0.8345.941±0.781F值1.533198.17016.874P值>0.05<0.01<0.05

注：与假手术组比较，aP<0.05；与PDTC组比较，bP<0.05

3讨论

CXC趋化因子是一类小分子分泌蛋白,参与炎性反应和免疫应答过程。CXCL16属于CXC趋化因子家族的膜结合蛋白,具有清道夫受体的作用和炎症属性，被认为在肾小球肾炎[4]、肝炎、心内膜炎[5]、肿瘤[6]及痛风[7]等炎性疾病中发挥重要的促炎作用。Lehrke等[8]研究认为，无论在体内或体外,炎症信号均能诱导CXCL16的表达，而CXCL16的高表达与冠心病的发生密切相关。CXCL16在炎性反应中发挥趋化因子的作用,能激活T淋巴细胞[5],活化的T淋巴细胞通过分泌γ干扰素、肿瘤坏死因子2β等炎性因子,以旁分泌的方式影响其周围细胞的功能活动，而γ干扰素又反过来诱导CXCL16 mRNA的表达增加[9]。Yellon等[10]研究显示，炎性反应是心肌缺血的病理基础，更是导致缺血再灌注损伤的重要病理生理机制。本研究结果显示，I/R组大白兔再灌注后CXCL16水平明显升高。CXCL16受到炎性刺激而表达并参与炎性反应，其水平升高提示可能通过炎性反应参与兔心肌缺血再灌注损伤过程。Zhao等[11]研究认为，CXCL16缺陷小鼠具有抗缺血再灌注损伤的心肌保护作用，本研究结论与其相似。

本研究发现，特异性抑制剂PDTC可降低缺血区和无复流区NF-κB的激活，提示NF-κB可能参与了心肌缺血再灌注对CXCL16水平变化的调节。NF-κB是一组真核细胞转录因子,由5种亚单位p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)、p65(RelA)、RelB、Rel(c-Rel)构成的二聚体蛋白。NF-κB最常见形式是p50-p65构成的异源二聚体,几乎存在于体内所有细胞,且含量极高。NF-κB具有与DNA结合的特性,活化的NF-κB常与靶基因结合促进其转录，从而通过下游分子如促炎细胞因子、黏附因子、趋化因子、凋亡调节基因、急性期蛋白血管紧张素Ⅱ及组织因子等参与调节炎性反应、免疫及细胞凋亡等重要细胞功能[12]。本研究结果显示,NF-κB在缺血再灌注心肌的缺血区和无复流区均明显激活，尤以缺血区显著。PDTC可通过抑制NF-κB的活性，降低CXCL16的表达，最终减少心肌缺血和无复流面积。因此，本研究认为，缺血再灌注可能激活心肌细胞NF-κB的表达，从而介导CXCL16的分泌，同时，CXCL16也加重炎性反应，进一步促进缺血再灌注损伤。

综上所述，CXCL16在NF-κB的调节下加剧了心肌缺血再灌注中的炎性反应，最终促进缺血再灌注损伤。上述结论为临床预防和治疗心肌缺血再灌注损伤提供了新的理论基础，但其具体信号转导机制有待进一步研究。

作者贡献：曾敏进行课题设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；李伟、蒙绪卿、符秀虹、陈积雄、王萍进行课题实施、评估、资料收集；魏欣进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

参考文献

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(本文编辑：吴立波)

【关键词】心肌再灌注；趋化因子CXCL16；信号传导；NF-κB

曾敏，魏欣，李伟，等.心肌缺血再灌注后CXC趋化因子配体16水平的变化及调节机制[J].中国全科医学，2016，19(5)：542-544，548.[www.chinagp.net]

Zeng M,Wei X,Li W,et al.Change and regulatory mechanism of the level of plasma CXC-chemokine ligand 16 after myocardial ischemia reperfusion[J].Chinese General Practice，2016，19(5)：542-544，548.

Change and Regulatory Mechanism of the Level of Plasma CXC-chemokine Ligand 16 After Myocardial Ischemia ReperfusionZENGMin,WEIXin,LIWei,etal.HainanProvincialPeople′sHospital,Haikou570311,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the change and regulation mechanism of the level of plasma CXC-chemokine ligand 16 (CXCL16).MethodsWe divided 30 New Zealand white rabbits into 3 groups:sham-operation group,cardiac ischemia/reperfusion(I/R) group and pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC) group.The PDTC group was administrated with 20 mg/kg PDTC by ear marginal vein injection,and 30 minutes later,the PDTC group and I/R group were administrated with coronary artery ligation;1.5 hours later,suture line was unbound;and the sham-operation group was only sutured without ligation.One hour after reperfusion,Thioflavine S was injected into atrium sinistrum,leaving no fluorescence staining in no reflow area.Ligation of left circumflex artery was made again at the primary site,and Evans blue was injected into atrium sinistrum again,with no blue stain area in ischemic area.After the animals were killed,ventricular slice was taken parallel to the atrioventricular groove,and the outlines of left ventricular wall,ischemic region and no reflow area were made manually on myocardial biopsy.During ligation,and 45 minutes,100 minutes and 150 minutes after ligation,ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA) anticoagulative tube was employed to sample 5 ml blood from ear marginal vein,and double antibody sandwich enzyme immunoassay was used to determine CXCL16 level.Myocardial tissue staining results of left ventricular septal area,ischemic region and no flow area were obtained,and the dyeing positive rate of cell nucleus was used to reflect the expression of NF-κB p65.ResultsThe area of myocardial ischemia and the no-flow area of PDTC group were both smaller than I/R group(P<0.05).Different intervention measures were significantly different in the influence on the level of CXCL16 at different time points (P<0.05).In I/R group,the level of CXCL16 at 100 minutes after ligation was higher (P<0.05) than that during ligation and 45 minutes after ligation.The three groups were significantly different in the dyeing positive rate of ischemic area and no-flow area (P<0.05);the ischemic area and no-flow area of the I/R group were higher than sham-operation group and PDTC group in the dying positive rate of cell nucleus (P<0.05).ConclusionMyocardial ischemia reperfusion could induce the expression of CXCL16,and the inhibition of the activation of NF-κB could reduce the level of CXCL16 and reduce the myocardial ischemia area and no flow area.

【Key words】Myocardial reperfusion；Chemokine CXCL16；Signal transduction；NF-kappa B

(收稿日期：2015-06-05；修回日期：2015-10-25)

【中图分类号】R 816.2

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.05.011

通信作者：曾敏，570311海南省海口市，海南省人民医院；E-mail：hndzm6@126.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81260043;81100153)；海南省应用技术研发与示范推广专项(ZDXM2014065)
作者单位：570311海南省海口市，海南省人民医院