HBV共价闭合环状DNA功能化纳米颗粒制备及鉴定

郭永灿， 王友强， 魏 聪， 邓 冲， 赵 容， 邹 霞， 涂植光

HBV共价闭合环状DNA功能化纳米颗粒制备及鉴定

郭永灿1， 王友强1， 魏 聪1， 邓 冲1， 赵 容1， 邹 霞1， 涂植光2

目的 制备HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)功能化磁性纳米颗粒，为进一步建立富集分离和检测cccDNA方法奠定基础。 方法 通过亲和素修饰纳米颗粒表面，利用亲和素与生物素的亲和作用，将亲和素修饰的纳米颗粒与生物素标记的cccDNA特异性探针偶联，制备cccDNA功能化纳米颗粒，最后用cccDNA探针完全互补的荧光标记序列与功能化纳米颗粒反应，鉴定其特性。 结果 亲和素修饰的纳米颗粒能结合生物素最大量为1 205 ng/mg；通过与亲和素作用，生物素标记cccDNA特异性探针固定在磁性纳米微粒表面，其最大结合生物素标记探针量为3.2×10-9mol/mg；cccDNA功能化纳米颗粒可捕获与其互补的荧光标记寡核苷酸序列，其最大捕获量为2.0×10-9mol/mg，并能通过变性释放出保持生物学活性游离的荧光标记寡核苷酸序列。 结论 成功构建的cccDNA功能化纳米微粒能有效捕获与其互补的序列，其捕获量能达到cccDNA的分离提取要求。

*DNA，病毒； DNA，环状； 纳米粒子

近年来，纳米技术迅速发展，被广泛应用到生物医学各个研究领域。以纳米或微米级磁性粒子为载体的磁性分离技术主要利用固定在粒子表面的蛋白质或单链核苷酸探针的亲和作用与靶分子或互补序列结合，目标靶分子因与磁性粒子特异性结合后在磁场作用下，通过抗原-抗体或核酸分子杂交、分离、清洗等简便、快速操作，从复杂的生物体系中被分离[1]。本研究拟通过已制备的磁性纳米微粒，经亲和素修饰，再与生物素标记HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)特异性探针偶联，制备cccDNA功能化纳米颗粒，为富集分离和检测cccDNA奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 链霉亲和素、生物素标记辣根过氧化物酶、四甲基联苯胺(美国Sigma公司)；PBST缓冲液(1×PBS，0.05% Tween-20)，STE(NaCl-Tris-EDTA)结合/清洗缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA， pH 7.4)，杂交缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl，pH 8.0)，PBS缓冲液(20 mmol/L Na2PO4/NaH2PO4，pH 7.5)等自配；其他化学试剂均为分析纯，购于北京索莱宝公司。

1.1.2 仪器 紫外可见分光光度计(ND1000，美国NanoDrop公司)；荧光分光光度计(2300EnSpire，芬兰PerkinElmer公司)；酶标仪(SunriseTM，奥地利Tecan公司)。

1.2.1 亲和素修饰纳米微粒的制备 将已制备的纳米颗粒用PBS配制为5 mg/mL的纳米悬浊液。取超声分散悬浊液500 μL，加入1 mg/L亲和素液50 μL，室温振荡24 h。反应毕，加入1 mL的戊二醛封闭反应2 h，PBS洗涤3次，磁性分离去上清，最后用1 mL PBS分散亲和素修饰磁性纳米微粒。取5支离心管，分别取100 μL已修饰磁性纳米悬浊液(含亲和素约5 μg)，每管加入10，20，40，60及80 ng生物素，反应20 min后各管加入经稀释生物素标记辣根过氧化物酶50 μL，避光反应20 min，加入TMB底物显色5 min后用2 mol/L H2SO4终止反应，然后用酶标仪检测各管溶液在450 nm处OD值。以生物素加入量为横坐标，相应吸光度为纵坐标，以95%生物素标记辣根过氧化物酶活性被抑制来计算亲和素修饰磁性纳米颗粒能结合生物素容量。

1.2.2 cccDNA特异性探针设计与合成 在GenBank数据库中查找人源HBV完整序列，剔除人工构建质粒序列，将余下的序列导入序列比对软件进行比对，找出顺向重复序列(direct repeat，DR)1和2区间的同源序列；将同源序列导入Oligo7(version 7.37)软件，设计cccDNA特异性的互补探针序列。将设计探针序列在Pubmed上进行BLAST比对后，对照相关文献[2-3]，验证后选定4条探针，分别是：

probe 1：5′ACTCTCAGCAATGTCAACGACCGACC3′(26 nt);

probe 2：5′CTTCGCTTCACCTCTGCACGT3′(21 nt);

probe 3：5′TGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAAT

TGGTCTGTT3′(35 nt);

probe 4：5′AGGTTAATGATCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTT3′(49 nt)

1.1 对象 选择2008年6月—2009年10月在上海市静安区静安寺社区卫生中心、曹家渡社区卫生中心、南京西路社区卫生中心的老年住院患者共202例，随机分为干预组和对照组各101例。

所有序列5′用生物素标记，交由生工生物工程(上海)股份公司合成和标记。

1.2.3 cccDNA功能化微粒制备 取亲和素修饰磁性微粒混悬液250 μL(含微粒约250 μg)，平均分为5管，每管加入一定量(5，10，15，20和25 μL)10 μmol/L生物素化标记寡核苷酸探针，在37 ℃恒温摇床中以150 r/min反应2 h。完毕后，磁性分离，以清洗缓冲液洗涤3次。测定偶联前后以及清洗后上清液在260 nm处的OD值，确定纳米颗粒与生物素化探针反应的最佳比例、偶联效率及固定化量。各组探针的偶联效率及固定化量符合反应要求，用封闭液进行封闭，制备cccDNA功能化微粒。

1.2.4 cccDNA功能化微粒鉴定 设计与生物素标记探针序列完全互补的寡核苷酸序列，同时设计与4条cccDNA序列完全不互补序列为对照序列(表1)，交由生工生物工程(上海)股份公司合成和标记。取50 μL功能化磁性微粒混悬液(约含微粒50 μg)，将FITC标记互补寡核苷酸探针配制为10 μmol/L应用液。共分为4个实验组(FITC标记探针分别为50,100,150和200 pmol)和1个对照组，反应体系：FITC标记探针5～20 μL，纳米微粒悬浊液 10 μL，5 mmol/L NaCl 10 μL，杂交缓冲液补足到100 μL；杂交反应管混匀后于62 ℃杂交反应30 min。反应完毕后，磁性分离，弃上清。再用清洗缓冲液充分洗涤磁微粒3次，分别用荧光显微镜观察杂交前后上清液荧光信号变化及用荧光分光光度计检测加入最适量探针各组在杂交前后荧光信号强度变化。

表1 与生物素标记探针互补的FITC标记寡核苷酸序列

2 结 果

2.1 亲和素修饰纳米结合生物素活性检测 生物素加入量为40，80及100 ng时，微粒结合生物素量已趋于饱和(图1)。因此，生物素标记辣根过氧化物酶95%被抑制点在20～40 ng(箭头所示)。按文献方法[4]，计算出25 μg亲和素修饰纳米微粒能结合生物素量为30.12 ng，每mg纳米颗粒能结合生物素量约1 205 ng。

2.2 纳米微粒与标记探针偶联效率检测 加入5，10，15和20 μL探针时上清液OD260值变化不大，但加入25 μL时，其吸光度值陡然上升，表明加入20 μL探针量已趋于饱和(图2，红色箭头所示)，以此计算出亲和素修饰纳米颗粒最大偶联探针量约4 000 pmol/mg[4]。纳米微粒与生物素标记探针偶联后，上清液吸光度明显降低(表2)。按公式计算各组探针相应值：

偶联效率=[(OD260偶联前-OD260空白)-(OD260偶联后-OD260空白)]/(OD260偶联前-OD260空白)×100%

探针固定量(mol/mg)=偶联效率×加入生物素标记探针量(mol/mg)

4组探针偶联效率分别为78.5%，84.0%，82.8%，81.8%，计算出亲和素修饰纳米微粒表面能固定探针量约3.2×10-9mol/mg(以加入探针量为20 μL计算)。4组纳米微粒固定探针量间均值比较，经t检验显示其差别无统计学意义(P>0.05，表2)。

组 别探针1(OD260)探针2(OD260)探针3(OD260)探针4(OD260)A1．427±0．080．606±0．071．501±0．112．269±0．13B0．285±0．040．059±0．020．224±0．030．368±0．07C0．022±0．010．038±0．010．034±0．010．046±0．01

A：偶联前； B：偶联后； C：对照组.

2.3 cccDNA功能化纳米颗粒鉴定 加入标记序列量为50 pmol和100 pmol时，杂交后上清液不能观察到明显荧光信号(图3A，3B)；加入量为150 pmol时，杂交后上清液能观察到明显的荧光信号(图3C)，说明其探针加入量超过功能化纳米颗粒最大捕获量。于是将100 pmol作为其最大探针捕获量，即功能化纳米颗粒对互补探针最大捕获量大约2.0×10-9mol/mg。荧光分光度计检测功能化纳米微粒与其互补FITC标记序列杂交后各组上清液荧光强度，实验数据见表3。从表中可见实验各组上清液荧光强度在杂交后明显下降，根据公式计算：

捕获效率=[(AU杂交前-AU空白)/AU杂交前]×100%

cccDNA功能化微粒对4组不同互补序列捕获效率均达97%以上(对照组为0.4%，探针1～4分别为97.9%，97.9%，97.7%，97.9%)。经t检验，各组与对照组比较，差别具有统计学意义(P<0.05)；而cccDNA功能化对4组不同互补序列捕获效率差别不具有统计学意义(P>0.05)。同时，将已捕获FITC互补序列的cccDNA功能化微粒悬浊液进行变性后，其上清的荧光强度又明显上升，根据公式计算：

释放率=[(AU变性后-AU空白)/(AU杂交前-AU杂交后)]×100%

4组微粒释放互补序列率达80%(分别为78.1%，84.1%，78.7%，77.8%)。4组间分别进行t检验，其均值差别无统计学意义(P>0.05)。通过各组杂交前后及变性后上清液荧光强度检测，表明结合有特异性cccDNA探针的磁性微粒能富集捕获与FITC标记互补寡核苷酸序列，又能通过变性有效地释放出保持的生物学活性游离的FITC标记寡核苷酸序列。

Tab 3 Capability of cccDNA nanoparticles to capture different complementary sequence by FITC-labeled AU

AU：吸光度单位. A:杂交前上清；B:杂交后上清；C:变性后上清.

3 讨 论

由于肝细胞内cccDNA含量低，且易受同源DNA，如松弛环状双链DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)、双链线性DNA (double strand linear DNA, dslDNA)、单链DNA(single strand DNA, ssDNA)等的干扰。因此，实现cccDNA特异和富集分离是定量检测cccDNA的关键。

纳米复合材料制备与应用过程的难题是纳米微粒团聚，而解决团聚的有效方法是在纳米微粒的表面进行如SiO2，Au，Ag等修饰。本文主要通过在SiO2修饰的磁性纳米微粒表面连接具有偶联特异性的靶向cccDNA探针来构建cccDNA功能化纳米微粒，而经SiO2修饰之后，纳米微粒团聚现象大大减少，有效增加了微粒表面结合亲和素的能力。亲和素-磁性微粒性能评价的参考方法就是亲和素-纳米微粒结合游离生物素的容量。用竞争抑制法对亲和素-纳米微粒结合生物素最大饱和结合容量分析表明，1 mg亲和素修饰硅化纳米颗粒能结合生物素量约为1 205 ng，与氨基修饰、Au修饰微粒结合游离生物素量基本一致[4-6]，结合量比未修饰微粒高6倍左右[5]。此外，根据rcDNA，ssDNA及dslDNA与cccDNA结构差别，设计4条长度不等的cccDNA特异性的探针序列。经亲和素和生物素的相互作用，将生物素标记探针固定到磁性微粒上，通过检测偶联前后磁性分离上清液OD260值变化，了解纳米微粒固化探针情况，判断构建cccDNA功能化纳米微粒的性能[7-8]。固定cccDNA探针前后，寡核苷酸溶液在260 nm的特征吸收峰有明显变化且OD260值均明显降低。通过计算，4组不同探针偶联效率约为80%，亲和素-磁性纳米微粒表面能固定的寡核苷酸探针量约为3.2×10-9mol/mg，比Au、氨基修饰微粒略高(2.8×10-9mol/mg)，是未修饰微粒寡核苷酸结合能力的8倍(26 bp)[5]。将cccDNA功能化磁性微粒表面固定的探针与FITC标记互补寡核苷酸探针进行杂交反应，验证cccDNA功能化微粒捕获性能[9-11]。结果显示，表面固定有探针的磁性微粒与FITC标记互补寡核苷酸探针杂交后上清液荧光明显减弱，与完全不互补的对照序列具有非常明显的差别，说明cccDNA功能化纳米颗粒能特异性捕获与其互补FITC标记寡核苷酸序列。通过计算，cccDNA功能微粒的最大捕获量为2.0×10-9mol/mg，捕获效率达97%以上。同时，cccDNA功能化微粒还能通过变性有效释放出保持生物学活性的游离FITC标记寡核苷酸序列。

综上所述，本研究利用磁性纳米微粒的超顺磁性以及亲和素-生物素特异偶联性，成功制备了cccDNA功能化纳米微粒，这种新型cccDNA分离的固相载体，价格低廉且具有较高的游离生物素结合容量以及较高的寡核苷酸的结合能力。此外，本研究首次就构建cccDNA功能化微粒进行研究，但以功能化微粒为载体的新型综合分离cccDNA技术尚需更大的样本以进一步证实。

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(编辑:张慧茹)

Preparation and Identification for Apecific Functionalized Nanoparticles of HBV Covalently Closed Circular DNA

GUO Yongcan1, WANG Youqiang1, WEI Cong1, DENG Chong1, ZHAO Rong1, ZOU Xia1, TU Zhiguang2

1.Clinical Laboratory of Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Southwest Medical University, Luzhou 646000；2.College of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016

Objective To prepare and identify specific nanoparticles of HBV cccDNA, and lay the foundation for enriching, separating, and detecting cccDNA in the future. Methods Initially, the silica-coated nanoparticles were modified by streptavidin. Then oligonucleotides for specific HBV cccDNA capture were designed and labeled by biotin. Moreover, oligonucleotides labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), which were completely complementary to capture probe, were synthesized and captured by functionalized nanoparticles for the characteristic validation. Results Streptavidin-modified nanoparticles could bind biotin, its maximum amount was about 1 215 ng/mg. In addition, streptavidin-modified nanoparticles had a high oligonucleotides binding capacity, its average amount of nucleic acid fixed was about 3 200 pmol/mg. After FITC-labeled sequences were added to the buffer and its hybridization with functionalized nanoparticles was performed, the fluorescence intensity of supernatant was decreased noticeably compared with that of pre-hybridization. Moreover, functionalized nanoparticles could capture up to about 2 000 pmol FITC-labeled sequences. Conclusion Specific functionalized nanoparticles of cccDNA can effectively capture the complementary sequences labeled by FITC, and the capture amount is enough to capture cccDNA in routine samples.

*DNA, viral； DNA, circular； nanoparticles

2016-08-22

泸州市重点科技计划项目(2014-S-49)；西南医科大学校级课题(2015-YJ028)

1.西南医科大学 附属中医医院检验科，泸州 646000； 2.重庆医科大学 检验医学院，重庆 400016

郭永灿，男，(1973-)，副主任技师，医学博士. Email：guoyongcan_2004@163.com

R342.3； R373.21； R392.11； R512.62

A

1672-4194(2016)06-0370-05