IL-10拮抗Pg-LPS所致高脂血症兔枯否氏细胞炎症反应的实验研究

李艳芬, 许雯静, 吴春芳, 游晓庆, 骆 凯, 闫福华

IL-10拮抗Pg-LPS所致高脂血症兔枯否氏细胞炎症反应的实验研究

李艳芬1, 许雯静2, 吴春芳1, 游晓庆1, 骆 凯1, 闫福华3

目的 探讨白细胞介素-10(IL-10)对牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)引起的高脂血症兔肝脏枯否氏细胞(KC)炎症反应的影响。 方法 健康新西兰兔12只随机分为2组，分别喂予基础饲料和高脂饲料。喂养6周后建立高脂血症模型。分离、收集KC，将正常和高脂组KC随机分为：对照组、Pg-LPS组(1 μg/mLPg-LPS刺激)、IL-10+Pg-LPS组(0.1 μg/mL IL-10+1 μg/mLPg-LPS刺激)。刺激24 h后，采用Griess法检测NO，Western-blot法检测NF-κB p65及IκB-α，DCFH-DA荧光检测细胞内ROS的表达。 结果 对照组中高脂KC的NF-κB p65蛋白及NO，ROS水平均高于正常KC。Pg-LPS作用后，正常及高脂KC的炎症物质表达量升高，且高脂血症与Pg-LPS呈协同作用。IL-10的干预处理使NO，ROS，NF- κB p65表达下降，IκB-α表达升高，对Pg-LPS所引起的炎症反应起抑制作用，对高脂KC的抑制作用更加明显。 结论 高脂血症可使KC处于相对激活状态。在牙周致病菌Pg-LPS作用下，高脂血症和Pg-LPS具有协同作用，IL-10可抑制Pg-LPS所致KC的炎性反应，且对高脂状态下KC的干预作用更佳。

*卟啉单胞菌, 牙髓； 脂多糖类； 白细胞介素10； 高脂血症； 炎症

高脂血症(hyperlipemia, HL)又称为血脂异常，是一种全身性疾病。在HL状态下，过多的脂质沉积于血管内皮，激活全身的单核/巨噬细胞系统，并吞噬脂质形成大量泡沫细胞，从而导致动脉粥样硬化和脂肪肝等病理性改变[1]。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是一种无过量饮酒、以肝实质细胞脂肪变及脂肪储积为特征的临床病理综合征，其发病率随着肥胖、HL群体的迅速增长而明显增高。枯否氏细胞(Kuffer cell，KC)是肝内固有的巨噬细胞，占全身单核/巨噬细胞总量的80%～90%，是NASH发生发展中重要的免疫细胞[2]。KC受诱导激活后可大量释放炎症因子，在脂肪肝到NASH的发展中起重要作用，也是诱发进展性肝纤维化的关键因素[3]。研究发现，牙周炎患者高水平的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可激活巨噬细胞的聚集，通过低密度脂蛋白形成泡沫细胞[4]。该结果提示牙周炎、HL、单核/巨噬细胞三者之间可能存在一定联系。白细胞介素-10(interleutin-10，IL-10)是一种免疫调节因子，具有潜在的抗炎和免疫抑制功能[5]。本研究拟通过检测牙龈卟啉单胞菌脂多糖(porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,Pg-LPS)作用下KC中一氧化氮(nitric oxide, NO)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、核因子-κp p65(nuclear factor-κp p65, NF-κp p65)和IκB-α的表达变化以及IL-10对其调控作用，以期为研究牙周病和肝脏疾病间的相关性提供新的细胞学证据。

1 材料与方法

1.1 动物 健康新西兰兔12只[中科院上海研究所动物中心，合格证号：SCXK(沪)2007-0007],(2.5±0.5)kg，雌雄不限,喂养于中国人民解放军南京军区福州总医院比较医学科。

1.2 试剂及仪器 RPMI-1640培养液(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；Ⅰ型胶原酶(美国Gibco公司)；Pg-LPS(美国Invitrogen公司)；DCFH-DA(美国Sigma公司)；IL-10(美国Pepro tech公司)；NO检测试剂盒(武汉碧云天生物技术公司)；兔抗兔NF-κB p65一抗(美国Abcam公司)；兔抗兔IκB-α一抗(武汉博士德生物公司)；冷冻高速离心机(德国Heraeus公司)；荧光倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 HL新西兰兔模型的建立 新西兰兔12只分笼饲养于20 ℃、70%湿度环境。适应性喂养1周后，随机分为2组。对照组予以基础饲料喂养，高脂组参照文献[6]喂以高脂饲料，配方：基础饲料+1%胆固醇+5%猪油+15%鲜蛋黄，每日喂养量控制为每只150～200 g，连续喂养6周。满6周后抽取耳缘静脉血，检测总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。

1.3.2 细胞的收集、纯化、培养 参照文献[7]的方法，禁食12 h后，戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉下，分离结扎肝门静脉和下腔静脉远心端，在下腔静脉近心端插管，引流肝内血液。在肝门静脉入肝处灌注4 ℃预冷的含肝素钠的D-Hank’s液，至肝内血液流出为土黄色，切下约4 g肝脏，剪碎至1 mm3大小，加入消化液(含0.005%DNase I、 0.1% Ⅰ型胶原酶的D-Hank’s液)，37 ℃水浴震荡消化30 min，200目细胞筛过滤2次，4 ℃、2 200 r/min离心10 min，弃上清，无血清RPMI 1640洗涤细胞沉淀2次后，重悬，加入含70%和30%梯度的percoll液，4 ℃、2 000 r/min离心25 min，吸取中间的云雾层，即为KC，加入含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液，接种，2 h后洗去非贴壁细胞，以巨噬细胞特异性抗体Macrophagemarker(MAC387)行免疫细胞化学鉴定，台盼蓝染色检测细胞存活率，存活率>95%可用。

1.3.3 实验分组及细胞处理 按不同检测方法的要求，将6只健康和6只高脂兔KC用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞密度进行接种，接种24 h后更换含1%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养2 h使其同步化。

实验分3组：对照组、1 μg/mLPg-LPS组、0.1 μg/mL IL-10+1 μg/mLPg-LPS组。参照文献[8-9]，对照组仅加入10%胎牛血清的RPMI 1640培养液；IL-10组先加入IL-10，使其终浓度为0.1 μg/mL，2 h后IL-10+Pg-LPS组和Pg-LPS组再分别加入Pg-LPS，使其终浓度为1 μg/mL。

1.3.4 采用Griess法检测NO 调整细胞密度为1×106mL-1，接种于6孔板，每孔1 mL。24 h后加药处理，继续培养24 h后，经0.02%EDTA+0.25%胰酶消化，收集细胞，离心后吸取50 μL上清于96孔细胞培养板中，BCA法进行蛋白定量，按Griess试剂盒说明书用酶标仪于波长540 nm测定吸光度，同时绘制标准曲线并计算得出个组产生的NO量。结果以NO浓度/蛋白含量比值表示。

1.3.5 DCFH-DA荧光检测细胞内ROS含量 调整细胞密度为2×105mL-1，接种于12孔板，每孔1 mL。24 h后，加药处理，继续培养24 h后，经0.02%EDTA+0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为2×105mL-1，加入500 μL终浓度为10 μmol/L DCFH-DA，充分混匀，在37 ℃条件下避光反应30 min。PBS缓冲液洗涤细胞3次，1 mL PBS重悬，荧光分光光度计检测荧光强度，激发波长488 nm，发射波长525 nm。

1.3.6 Western-blot法检测NF-κB p65及IκB-α表达水平 调整细胞密度为1×106mL-1，接种于直径60 mm培养皿，每皿3 mL。24 h后加药处理并继续培养24 h。PBS缓冲液洗涤细胞1次，用细胞刮子收集细胞，PBS缓冲液洗涤细胞2次。采用胞核/胞质蛋白提取试剂盒提取KC的胞质蛋白和胞核蛋白，并分装于-80 ℃冻存备用。用BCA法蛋白定量并配平各上清液浓度。取配平后的各上清液80 μL，100 ℃、10 min变性后，经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿法转膜，将蛋白转移至0.45 μm孔径PVDF膜，5%脱脂奶粉、37 ℃封闭1 h后，分别加入1∶200的NF-κB p65一抗、1∶200的IκB-α一抗、1∶300的鼠抗兔GAPDH一抗和1∶300的兔抗兔β-actin一抗，4 ℃孵育过夜后用1∶5 000辣根过氧化物酶HRP标记羊抗鼠二抗及辣根过氧化物酶HRP标记羊抗兔二抗，37 ℃轻摇1 h，化学发光法显色，胶片曝光。通过Quantity One 4.6.2进行灰度值定量，以各组KC中NF-κB p65/GAPDH、IκB-α/β-actin扫描灰度值计算各组细胞中NF-κB p65及IκB-α的相对表达水平。实验重复3次。

2 结 果

2.1 血脂检测结果 第6周时，高脂组的TC，TG，HDL-C及LDL-C均明显高于对照组，差别具有统计学意义(P<0.05)。参照HL的诊断标准[10]，表明在第6周时，新西兰兔HL动物模型已成功建立(表1)。

2.2 KC细胞鉴定 免疫细胞化学染色显示KC中MAC387呈阳性表达(图1)。

表1 血脂水平比较

n=6. TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白；LDL-C：低密度脂蛋白. 与对照组比较，△:P<0.05.

2.3 不同处理方式对KC分泌NO的影响 按照Griess试剂盒的说明书绘制标准曲线，计算各不同处理组相对NO含量。对照组中高脂KC的NO分泌量显著高于正常KC的分泌量(P<0.05)。加入Pg-LPS刺激后，高脂及正常KC的NO分泌量均显著上升(P<0.05)，且高脂KC的NO分泌量高于正常KC，提示高脂和Pg-LPS呈现叠加作用。IL-10对Pg-LPS引起正常KC和高脂KC的炎症反应具有抑制作用，NO分泌量均降至接近正常对照组水平，显著低于对照组中高脂KC的分泌量(P<0.05，图2)。

2.4 不同处理方式对KC中ROS含量的影响 DCFH-DA染色后，荧光酶标仪检测结果表明，Pg-LPS的刺激可使KC中ROS的含量显著上升(P<0.05)。IL-10作用后ROS含量均显著下降(P<0.05)。对照组中高脂KC的ROS表达较正常KC显著升高(P<0.05)。在Pg-LPS刺激后，ROS升高尤为明显，高于同组中正常KC的表达量(P<0.05，图3)。

2.5 不同处理方式对KC中NF-κB p65及IκB-α表达水平的影响 Western-blot法检测结果表明，Pg-LPS刺激下正常KC中NF-κB p65及IκB-α表达水平与对照组中正常KC比较无统计学差别；IL-10干预后，与对照组中正常KC比较，NF-κB p65表达水平显著下降(P<0.05)，IκB-α表达水平显著上升(P<0.05)。对照组中高脂KC的NF-κB p65表达水平比正常KC的表达显著上升(P<0.05)，加入Pg-LPS后高脂KC中NF-κB p65的表达水平显著高于对照组中高脂KC的表达，也高于Pg-LPS作用后正常KC的表达(P<0.05)；加入IL-10后，炎症被明显抑制，降至对照组正常KC水平(P<0.05)。对照组中高脂KC的IκB-α表达水平与正常KC比较无统计学差别，Pg-LPS刺激后高脂KC的IκB-α表达水平显著下降(P<0.05)；IL-10干预后，高脂及正常KC的IκB-α表达水平与对照组比较均显著上升，且高脂KC的表达水平显著低于正常KC(P<0.05，图4，5)。

3 讨 论

HL是指脂质代谢或转运异常伴血脂水平过高，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病。研究显示，HL状态下，血液中IL-6,IL-8等炎症因子的水平升高，与动脉粥样硬化等多种全身性疾病密切相关[11]。相关机制可能是：HL时，为清除过多的脂质，全身单核/巨噬细胞大量增生，功能紊乱，导致对LPS敏感性上调，炎症因子表达增加[12]。活化后的巨噬细胞可分泌多种生物活性物质，如ROS,NO,IL-1等。其中NO和ROS具有多种生物学功能[13]，是重要的免疫调节因子，还具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等活性。研究发现，NO与炎症损伤的多个致病环节密切相关[14]。巨噬细胞在受到免疫或炎症刺激可合成诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)产生大量NO，并与超氧阴离子等氧自由基反应，增加了其对组织细胞的细胞毒性效应[15]。高水平的ROS能诱导氧化应激和炎性反应，进而导致生化与生理损伤[16]。NF-κB是一类重要的转录激活因子，在许多肿瘤性疾病和炎症中，NF-κB表达增强，从而调节许多与免疫功能和炎症有关的基因[17]。NF-κB主要由P50和P65两亚基组成，在细胞静息状态时与抑制因子IκB结合，形成NF-κB/IκB复合体，使NF-κB以无活性的形式存在于细胞质中，一旦被胞外刺激信号刺激后，IκB激酶激活，IκB蛋白磷酸化并被蛋白酶降解，NF-κB与IκB解离，活化的NF-κB转入核内调控基因表达[18]。IκB的降解程度可决定NF-κB的活化水平，IκB的含量与NF-κB的活化水平成反比。研究发现，ROS可通过细胞信号系统调控，活化NF-κB p65-P50异源二聚体，从而激活NF-κB[19]。何姜等研究发现，NF-κB p65蛋白表达的增加会导致iNOS表达增加，从而引起细胞NO水平升高[20]。本研究发现，对照组中高脂KC的NF-κB p65蛋白及NO,ROS水平均高于正常KC，提示HL新西兰兔KC处于一种相对激活状态，与之前研究结果相符。

Pg-LPS可通过与单核/巨噬细胞表面的受体结合，使宿主免疫体系激活，引起全身的炎症反应。研究表明，LPS通过Toll受体、MD2及CD14等膜表面受体与KC结合[21]，诱导NF-κB及AP-1等磷酸化和核移位[22]，KC激活后释放氧化亚氮、超氧负离子等活性氮的中间产物，活性脂质、细胞因子等免疫反应所必需的介质，而这些介质的过多释放将导致细胞的坏死和组织的损伤[23]。本研究观察到，在Pg-LPS刺激下，不仅正常KC的ROS,NO表达量与对照组中正常KC显著升高，高脂KC的ROS,NO,NF-κB p65表达量与对照组中高脂KC比较，也显著升高。同时，IκB-α的表达量却显著下降，且上述结果与Pg-LPS刺激下正常KC比较，差别也有统计学意义。Pg-LPS+高脂KC组表达量变化与对照组、Pg-LPS+正常KC组比较，差别也有统计学意义(P<0.05)，说明牙周致病菌Pg-LPS对KC有诱导活化作用，使其分泌的炎症介质增加。HL和Pg-LPS对KC的诱导活化作用具有协同作用，提示患有牙周炎的HL患者罹患NASH的风险可能要大于单纯的牙周炎患者和HL患者。

IL-10具有抗炎和免疫抑制作用，在巨噬细胞和T细胞介导的急性肝损伤中具有显著的肝脏保护作用[24]。夏阳等研究表明，IL-10可以抑制由TNF-α诱导的肝星状细胞激活，在肝脏早期炎症和肝纤维化进程中起保护作用[25]。本实验结果表明，0.1 μg/mL IL-10对Pg-LPS所引起的正常和HL新西兰兔KC的炎症反应都起到抑制作用，并且对HL新西兰兔炎症介质下调的幅度明显大于正常新西兰兔，提示外源性的IL-10对KC活化后诱导的炎症反应起抑制作用，有利于保护肝脏的正常组织、细胞和功能，且可能对HL患者的肝脏保护效果更显著。

综上所述，Pg-LPS能有效地诱导KC活化，从而引起一系列炎症介质、生物活性物质等的表达和释放，对肝的正常组织细胞产生损害，特别是HL的患者，加大其罹患NASH的风险。IL-10能有效地降低Pg-LPS所产生的炎症反应，且对HL个体的炎症抑制作用更加明显。研究结果可能为深入探讨牙周病与肝脏疾病的关系和防治方法提供新的细胞学证据。

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(编辑:张慧茹)

Experimental Study of IL-10 anta Ponizing Inflammatory Reaction of Kuffer Cell Induced byPg-LPS in Hyperlipidemia Rabbit

LI Yanfen1, XU Wenjing2,WU Chunfang1, YOU Xiaoqing1, LUO Kai1,YAN Fuhua3

1.Department of Periodontology,School and Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, China;2.Department of Stomatology, People’s Hospital of Fujian Province, Fuzhou 350004, China;3. Nanjing Stomatological Hospital, Medical School of Nanjing University, Nanjing 210008, China

Objective To explore the effect of interleukin-10 on inflammatory reaction of Kuffer cell following thePg-LPS stimulation in hyperlipidemia rabbit. Methods 12 New Zealand rabbits were randomly divided into two groups and were fed with normal or high fat diet. The hyperlipidemia model was established 6 weeks later. We isolated and cultured the Kuffer cells (KC). Both normal and hyperlipidemia group were divided into 3 groups: control,Pg-LPS at 1 μg/mL, andPg-LPS at 0.1 μg/mL IL-10+1 μg/mL. After the treatment for 24 h, NO levels were detected by Griess assay. NF-κB p65 and IκB-α fragment were inspected by Western blot. ROS levels were determined by fluorescence enzyme-labelled meter with DCFH-DA as fluorescent probe. Results The levels of NF-κB p65,NO and ROS were higher in hyperlipidemia control group than in normal control group. After being stimulated byPg-LPS, the expression of inflammatory substances was increased indicating a synergistic effect between hyperlipidemia andPg-LPS. Under the IL-10 treatment the expression of NO,ROS,NF-κB p65 were decreased, while the expression of IκB-α was increased. IL-10 inhibited the inflammatory reaction induced byPg-LPS, and the inhibition was more significant in the KC of hyperlipidemia rabbit. Conclusion The KC of hyperlipidemia rabbit is in a relatively activated condition, after being stimulated byPg-LPS, hyperlipidemia andPg-LPS present a synergistic effect. IL-10 can inhibit the inflammatory reaction of KC after thePg-LPS stimulation, and the effect is better for the KC with hyperlipidemia.

porphyromonas endodontalis； lipopolysaccharides； interleukin-10； hyperlipidemias； inflammation

2016-08-22

国家自然科学基金(30973326)；福建省自然科学基金(2013J01306)；福建省教育厅科研基金(JA11123)

1.福建医科大学 附属口腔医院牙周科，福州 350002; 2.福建省人民医院 口腔科，福州 350004; 3.南京大学医学院 附属口腔医院，南京 210008

李艳芬(1979-),女,副主任医师，医学博士

闫福华. Email: fhyan2005@126.com

R332； R378.84； R392.12； R977

A

1672-4194(2016)06-0359-06