2014年成都某院流感嗜血杆菌的临床分布及耐药分析

罗宇鹏

(成都市第五人民医院检验科，四川成都 611130)



·论著·

2014年成都某院流感嗜血杆菌的临床分布及耐药分析

罗宇鹏

(成都市第五人民医院检验科，四川成都 611130)

摘要:目的探讨该院临床分离的流感嗜血杆菌分布及抗菌药物的耐药情况。方法以该院2014年1～12月所有已筛查合格且培养为阳性的下呼吸道标本1 895份、血液类标本666份、尿道分泌物标本102份，共2 663份标本分离出的流感嗜血杆菌438株为研究对象，采用头孢硝基噻吩纸片测定其β-内酰胺酶，用纸片扩散法(K-B法)测定其对8种抗菌药物的敏感性，利用WHONET5.6软件对试验数据进行统计分析。结果438株流感嗜血杆菌中98.6%来自住院患者，1.4%来自门诊；儿童分离株有176株，占40.18%；老年患者分离株194株，占44.29%；下呼吸道标本来源434株，占99.09%。对复方磺胺甲噁唑耐药率最高，达82.90%，氨苄西林和四环素的耐药率分别为43.40%、29.00%；而头孢呋辛、头孢曲松、环丙沙星、阿奇霉素、亚胺培南的耐药率均在2.00%以下。β-内酰胺酶的阳性率为43.40%，在氨苄西林耐药菌株中有1.57%的菌株β-内酰胺酶检测阴性。儿童分离株对氨苄西林的耐药率和产酶率(42.40%、40.43%)和成人分离菌株对氨苄西林的耐药率及产酶率(44.00%、44.00%)没有明显差异。结论流感嗜血杆菌主要分离自下呼吸道标本中；以儿童和老年患者为主，第二、三代头孢菌素类与阿奇霉素可作为临床首选药物，β-内酰胺酶是该菌对氨苄西林耐药的主要机制。

关键词:流感嗜血杆菌；耐药性；抗菌药物；β-内酰胺酶

流感嗜血杆菌一般存在于人类的上呼吸道中，只侵犯人类的革兰阴性苛养细小细菌，也是社区获得性肺病(CAP)、慢性支气管炎急性发作(AECG)的常见病原菌之一，可侵入血液、脑脊液及皮肤黏膜等引起败血症、脑膜炎、肺炎、脓毒关节炎等[1-2]。近年来，由于抗菌药物的不合理使用，流感嗜血杆菌的耐药率不断上升，为了解本院流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药率，指导临床合理用药，对本院2014年全年所有培养标本分离出的流感嗜血杆菌进行分离鉴定、β-内酰胺酶检测及纸片扩散法(K-B)法药敏试验，并进行耐药性分析。

1资料与方法

1.1一般资料收集2014年全年本院门诊及住院患者所有已筛查合格且培养为阳性的下呼吸道标本1 895份、血液类标本666份、尿道分泌物标本102份，共2 663份标本分离出流感嗜血杆菌438株；考虑到流感嗜血杆菌的致病性及分离检出率，其他常见临床标本如咽拭子、灌洗液、脑脊液等未纳入统计。

1.2仪器与试剂哥伦比亚血琼脂、麦康凯、巧克力培养基(含万古霉素)、HTM药敏培养基、脑心浸液琼脂培养基、革兰染液均由成都瑞琦生物有限公司提供；胰蛋白消化酶粉由上海源聚生物科技公司提供；普通孵育箱、二氧化碳孵育箱、BD FX400血培养仪Olympus CX31显微镜、游标卡尺等。复方磺胺甲噁唑(SXT)、氨苄西林(AMP)、环丙沙星(CIP)、头孢曲松(CRO)、头孢呋辛(CXM)、阿奇霉素(AZM)、四环素(TCY)、亚胺培南(IPM)、V因子、X因子、(V+X)因子及β-内酰胺酶药敏纸片均购自英国OXOID公司；质控菌株为流感嗜血杆菌ATCC49247、流感嗜血杆菌ATCC49766(补充ATCC49247不能涵盖的药敏质控)、金黄色葡萄球菌ATCC25923。

1.3方法

1.3.1下呼吸道标本(1)下呼吸道标本的采集。漱口，深呼吸咳深部痰液于无菌杯送检；晨痰最佳。(2)下呼吸道标本的筛查。直接或通过洗涤后达到显微镜镜下白细胞数目不低于25个/高倍镜，上皮细胞不高于10个/低倍镜视为合格标本，进一步洗涤匀质化；若镜下白细胞数目小于25个/高倍镜，视为不合格标本[3]。(3)下呼吸道标本的洗涤、涂片、匀质化及接种孵育。对于合格的痰液标本，加入适量的生理盐水进行洗涤，挑取脓性痰液部分进行涂片染色镜检，同时加入胰蛋白酶粉(浓度为1%)35 ℃进行匀质化60～90 min后，分区划线接种哥伦比亚血琼脂、麦康凯、巧克力培养基，麦康凯培养基放置普通孵育箱孵育(35 ℃，18～24 h)，哥伦比亚血琼脂及巧克力培养基放置CO2孵育箱孵育(35 ℃ 5%CO218～24 h)。

1.3.2血液类标本标本采集由临床护士完成，直接采集8～10 mL血液注入成人血培养瓶，放置BD FX400血培养仪直接孵育，阳性报警则涂片接种培养基。

1.3.3尿道分泌物标本(1)尿道分泌物的采集。由皮肤科医生或外科医生采用专用尿道拭子伸入尿道3～4 cm处，停留5 s，再旋转退出，放入无菌管内。(2)尿道分泌物的筛查。加入适量生理盐水润湿，涂片染色镜检；镜检标准及接种培养基同灌洗液。

1.3.4致病菌与定植菌(或污染菌)的区分(1)下呼吸道、咽拭子、灌洗液及尿道分泌物等标本。脓细胞内涂片查见革兰阴性细小短杆菌，视为致病菌；未查见则视为定植菌。(2)血液及脑脊液标本。涂片查见革兰阴性细小短杆菌，视为致病菌。

1.3.5细菌分离培养及鉴定哥伦比亚血琼脂培养基不生长或生长细小，麦康凯培养基不生长，巧克力培养基生长，革兰染色为革兰阴性细小或呈扭曲之长丝状；在巧克力培养基上菌落灰色/无色、半透明、露滴样菌落，0.6～2.0 mm为流感嗜血杆菌；挑取可疑菌落做成0.5麦氏菌液浊度，再按要求接种于脑心浸液培养基和哥伦比亚血琼脂培养基，分别点种金黄色葡萄球菌进行卫星试验，在脑心浸液培养基上贴上V因子、X因子及(V+X)因子3种生长因子，35 ℃孵育24 h，如哥伦比亚血琼脂培养基上卫星试验阳性且不溶血的菌落、脑心浸液培养基上卫星试验阴性、(V+X)因子阳性、V因子和X因子阴性则鉴定为流感嗜血杆菌。

1.3.6药敏试验采用K-B法分别进行SXT、AMP、CIP、CRO、TCY、CXM、IPM、AZM等8种抗菌药物的敏感性测定，按照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2014版的判定标准测量抑菌环直径，以及判定耐药及敏感性。

1.3.7质控采用流感嗜血杆菌ATCC49247及ATCC49766进行药敏试验质控，采用流感嗜血杆菌ATCC49247及金黄色葡萄球菌ATCC25923进行因子纸片、哥伦比亚血琼脂培养基及巧克力培养基质控。

1.4统计学处理采用WHONET 5.6进行统计分析。

2结果

2.1流感嗜血杆菌分布情况在438株流感嗜血杆菌中，98.6%来自住院患者，1.4%来自门诊；科室的分布中儿科最高37.67%，其次为内科37.21%，重症监护室5.94%，外科3.88%，血液肿瘤科2.28%，感染科1.37%，其他科室11.64%；年龄10岁以下占40.18%，10～<20岁占0.68%，20～<30岁占0.68%，30～<40岁占1.14%，40～<50岁占3.65%，50～<60岁占9.36%，60岁及以上占44.29%。标本类型以下呼吸道标本分离菌株最多，为434株，血液标本中分离2株，尿道分泌物标本中分离2株。见表1。

表1　　438流感嗜血杆菌标本来源、科室分布及

2.2药敏试验438株分离菌株中共检测出190株(43.40%)产β-内酰胺酶菌，在氨苄西林耐药菌株中有3株(1.57%)未检测出β-内酰胺酶，438株流感嗜血杆菌对各种抗菌药物的敏感性见表2(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

3讨论

流感嗜血杆菌是条件感染性致病菌，正常情况下存在于人的上呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道，不引起任何感染，但在适当条件下，如病毒感染或免疫力下降则会侵入呼吸道黏膜、血液及脑脊液引起感染而出现临床症状。与本院2014年所分离到的流感嗜血杆菌来自下呼吸道标本、血液及尿道分泌物标本中的结果相符。

流感嗜血杆菌是CAP、AECG常见致病菌之一，但在本研究中检出该菌的患者主要以住院患者为主，占98.6%，而门诊患者却很少，可能的原因是流感嗜血杆菌耐药率低，门诊患者自己经验性滥用抗菌药物或临床医生经验性使用抗菌药物过多有关，从而造成门诊阳性率偏低；但这从另一方面反映了在抗菌药物使用前采集合格的标本及合理使用抗菌药物的重要性；本研究中检测的438株流感嗜血感染主要来自儿童(占40.18%)及老年患者(占44.29%)，老年患者所占比例略高于儿童患者。以上结果很好地证明了流感嗜血杆菌是CAP、AECG常见致病菌之一，且由于儿童及老年患者的抵抗力较弱，所以感染率相对较高，与中国大部分地区相似[1-4]。

在体外药敏试验中，对流感嗜血杆菌耐药率最高的为复方磺胺甲噁唑，达82.90%，且儿童组(88.80%)的耐药率要高于成人组(79.40%)；其次为氨苄西林，占43.40%，儿童组(42.40%)和成人组(44.40%)差别不大。青霉素类抗菌药物原为治疗流感嗜血杆菌的首选药物，但是由于临床抗菌药物的不合理使用，从而导致耐氨苄西林的耐药株不断增加，给诊断和治疗带来了一定的困难，所以本地区现不宜用氨苄西林和复方磺胺甲噁唑作为流感嗜血杆菌感染的经验性用药。而其他的抗菌药物，如头孢呋辛、头孢曲松、环丙沙星、阿奇霉素、亚胺培南的耐药率均较低，对于流感嗜血杆菌感染，上述药物均有很好的抗菌活性，可以适当选择，但喹诺酮类药物会影响儿童软骨发育，且由于有很强的诱导耐药性，一般不推荐用于18岁以下患者。

流感嗜血杆菌的耐药性主要是由于β-内酰胺酶的产生、青霉素结合蛋白的改变，以及细胞膜对抗菌剂通透性的改变所引起。流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药于1972年首先在欧洲报道，主要耐药机制是产生质粒介导的β-内酰胺酶，有90%以上为TCYM-1型基因，少数为ROB-1型基因[5]，β-内酰胺酶可灭活氨基青霉素、羧基青霉素和脲基青霉素。在氨苄西林耐药菌株中，有3株未检测出β-内酰胺酶，本试验中β-内酰胺酶的检出率为1.57%，与国外报告的β-内酰胺酶阴性菌的氨苄西林耐药率接近[6]，耐药性通常是由于一种或多种青霉素结合蛋白的改变和外膜蛋白通透性下降所引起，且影响所有的β-内酰胺酶类药物，但各菌株的耐药水平有差异。这些菌株所致感染的临床治疗结果不确定，其耐药机制有待进一步研究[7-8]。

综上所述，流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率有增高趋势，在用药过程中应进行细菌培养，及时调整抗菌药物，微生物室应通知临床医生合理使用抗菌药物，应重视和加强流感嗜血杆菌的培养及耐药性监测工作，特别对于儿童和老年患者，进行细菌培养对提高其患者治愈率，延缓细菌耐药性具有非常重要的意义。

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Clinical distribution of Hemophilus influenzae and its drug resistance analysis

LuoYupeng

(DepartmentofClinicalLaboratory,ChengduMunicipalFifthPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan611130,China)

Abstract:ObjectiveTo study the distribution of clinically separated Hemophilus (H.) influenzae and its drug resistance situation.MethodsAmong 2 663 specimens of screening qualified and positive culture collected from the outpatients,inpatients and emergency patients of our hospital from January to December 2014,including 1 895 specimens of lower respiratory tract,666 blood specimens and 102 urinary secretion specimens,438 strains of H.influenzae were isolated.The cephalosporin nitro thiophene paper test strip was used to test its beta lactamase and the K-B method was used to detect its sensitivity to 8 kinds of antibacterial drugs.The testing data were statistically analyzed by using WHONET5.6 software.ResultsAmong 438 strains of H.influenzae,98.6% was originated from hospitalized patients,1.4% from the outpatient department;176 isolated strains were originated from children,accounting for 40.18%;194 strains (44.29%) were from elderly patients,434 strains(99.09%) were originated from the lower respiratory tract specimens.The resistance rate to compound sulfamethoxazole was highest and reached 82.90%,which to ampicillin and tetracycline were 29.00% and 43.40% respectively;but which to cefuroxime,ceftriaxone,ciprofloxacin,azithromycin,imipenem were below 2.00%.The β-lactamase positive rate was 43.40%,in ampicillin resistant strains,1.57% of strain was negative in β-lactamase test.The resistance to ampicillin and enzyme production rate had no significant differences between the children isolated strains and adult isolated strains (42.43%,42.40%vs. 44.00%,44.00%).ConclusionH.influenzae is mainly isolated from lower respiratory tract specimens;which is dominated by children and elderly patients;the second and third generations of cephalosporins and azithromycin can serve as a clinical preferred drugs;β-lactamase is the primary mechanism of resistance to ampicillin.

Key words:Hemophilas influenzae;drug resistance;antibacterial agents;β-lactamase

(收稿日期：2015-06-02)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.018

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)03-0333-03

作者简介：罗宇鹏，男，主管检验技师，主要从事临床微生物检验研究。