358例肺癌患者K-ras基因的突变分析

卢丽琴，李　纲

(1.浙江省人民医院肿瘤内科，浙江杭州 310014；2.上海复旦大学附属肿瘤医院闵行分院肿瘤科，上海 201100)



·论著·

358例肺癌患者K-ras基因的突变分析

卢丽琴1，李纲2△

(1.浙江省人民医院肿瘤内科，浙江杭州 310014；2.上海复旦大学附属肿瘤医院闵行分院肿瘤科，上海 201100)

摘要:目的分析358例肺癌患者K-ras基因突变的突变情况，为肺癌患者的个体化治疗提供指导。方法通过嵌套和低变性温度下的复合PCR(COLD-PCR)-测序法分析358例肺癌患者K-ras基因突变状态。结果在358例肺癌患者中，K-ras基因总体突变率为8.10%。94份血浆标本、250份肿瘤组织标本、14份胸腔积液及腹水标本中的突变率分别为2.13%、9.60%、7.14%。突变类型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D、Q61H，3种不同标本之间K-ras基因的突变率比较，差异无统计学意义(P=0.064 8)；男性与女性患者的突变率分别为6.96%、8.59%，差异无统计学意义(P=0.574 0)；30～<45岁、45～<60岁、大于或等于60岁患者中的突变率分别为4.76%、5.34%、9.22%，不同年龄段患者K-ras基因的突变率比较，差异无统计学意义(P=0.250 3)。结论肺癌患者K-ras基因突变类型主要为G12C、G12D、G12V、G13D，K-ras基因在不同标本类型、不同性别、不同年龄之间的突变率无明显差异。

关键词:肺癌；K-ras基因；基因突变状态

世界卫生组织2014年报告指出，癌症是世界范围内导致死亡的首要原因，2012年有1 400万新发癌症病例，820万人因癌症死亡，新发病例数预计还将增加。2012年，男性发病率最高的是肺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃癌和肝癌，女性发病率最高的是乳腺癌、结直肠癌、肺癌、宫颈癌和胃癌。肺癌是引起人类死亡最多的一种癌症。世界新发病例中超过60%发生在非洲、亚洲和中南美洲，主要是由于吸烟、饮酒、不健康饮食和缺乏锻炼所引起。

肺癌是世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，后者占了80%，大部分确诊的肺癌患者都处在晚期或已经发生了转移[1],化疗是这部分患者可选的一种治疗方法，但也只能增加几个月的生存期[2]，表皮生长因子受体(EGFR)信号通路在细胞的增殖、生长、分化和迁移中发挥着重要的作用，这条通路的下游因子包括RAS/RAF/MAPK,编码这条通路蛋白的基因突变可能都会影响到针对EGFR信号通路设计的靶向药物的疗效，因此，对这部分基因的检测，就成为药物能否使用的一个预测性生物标记物[3-6]。

1材料与方法

1.1标本来源358份临床标本来自全国上百家三级医院358例肺癌患者，包括94份血浆标本、250份组织标本和14份胸腔积液及腹水标本；其中来自男性230份，来自女性128份；来自30～<45岁患者21份，45～<60岁患者131份，≥60岁患者206份。所有参与本研究的肺癌患者或其家属均签署授权书，对上海赛安生物医药科技有限公司进行K-ras基因检测知情同意。

1.2仪器与试剂离心机购自湘仪离心机仪器有限公司，PCR仪购自杭州博日科技有限公司，PCR产物序列测定由上海鼎安生物科技有限公司完成。DNA提取试剂盒购自Axygen Scientific Inc，Pfu酶购自上海申能博彩生物科技有限公司，dNTP购自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.3检测方法(1)基因组DNA的提取按照试剂盒说明书进行。(2)低变性温度下的复合PCR(COLD-PCR)-测序法检测K-ras基因突变状态。用primer 5进行引物设计，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，嵌套和COLD-PCR-测序法被用于检测K-ras基因的突变。第1步进行 PCR扩增,常规PCR反应体系(10 μL)包括0.25 mmol/L的dNTP、0.5 μmol/L的引物、0.5单位的Taq DNA聚合酶和10 ng的模板DNA。PCR程序如下：95 ℃预变性3 min，接着进行32个扩增循环，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，然后72 ℃保持5 min。常规PCR方法被用于扩增465 bp的大片段。所用引物为：正向5′-GTC GAT GGA GGA GTT TGT AAA TGA AGT-3′和反向 5′-TTC AGA TAA CTT AAC TTT CAG CAT AAT TAT CTT G-3′。第2步进行COLD-PCR，COLD-PCR反应体系(50 μL)包括：0.25 mmol/L的dNTP、0.5 μmol/L的引物、0.5单位的Taq DNA聚合酶和1 μL的大片段PCR产物。PCR程序如下：95 ℃预变性3 min；先进行40个扩增循环，80 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；随后进行15个扩增循环，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；然后72 ℃，保持5 min。COLD-PCR方法用于扩增155 bp的小片段。所用引物为：正向5′-GTC ACA TTT TCA TTA TTT TTA TTA TAA GG-3′和反向5′-TTT ACC TCT ATT GTT GGA TCA TAT TC-3′。第3步进行PCR产物纯化测序，由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.4统计学处理采用SPSS20.0软件进行数据处理及统计学分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1PCR产物测序结果采用COLD-PCR-测序法检测K-ras基因突变状态，其代表性结果见图1，显示肺癌患者K-ras基因第13位密码子由GGC突变为GAC。

2.2不同标本类型肺癌患者K-ras基因的突变情况本研究检测了358例肺癌患者，K-ras基因总体突变率为8.10%。94份血浆标本的突变率为2.13%，250份组织标本的突变率为9.60%，14份胸腔积液及腹水标本的突变率为7.14%，突变类型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D、Q61H，3种不同标本K-ras基因的突变率比较，差异无统计学意义(P=0.064 8)，见表1。

图1　　对COLD-PCR产物测序的代表性图谱

2.3不同性别肺癌患者K-ras基因的突变情况K-ras基因在230例男性患者中的突变率为6.96%，突变类型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D，在128例女性患者中的突变率为8.59%，突变类型包括G12D、G12V、G13D、Q61H。不同性别K-ras基因的突变率比较，差异无统计学意义(P=0.574 0)，见表1。

2.4不同年龄群体肺癌患者K-ras基因的突变情况K-ras基因在21例30～<45岁患者中的突变率为4.76%，突变类型为G13D，131例45～<60岁患者中的突变率为5.34%，突变类型包括G12C、G12D、G12V、G13D，206例大于或等于60岁患者中的突变率为9.22%，突变类型包括G12C、G12D、G12A、G12V、G13D、Q61H。不同年龄段患者K-ras基因的突变率比较，差异无统计学意义(P=0.250 3)，见表1。

表1　　采用COLD-PCR-测序法检测肺癌患者K-ras基因的突变频率[n(%)]

-：无数据。

3讨论

循环肿瘤细胞(CTCs)是原发肿瘤转移过程中释放的中间产物，它有潜力为研究肿瘤的特征提供可用的生物活性物质，从而监测肿瘤的治疗，CTCs能从血液中富集，并通过CellSearch®系统进行计数，目前这种方法已经被美国食品药品管理局(FDA)批准用于肺癌的相关检测，判断药物反应和疗效[7-9]。但是CTCs最大的问题是如何有效地富集血液中的肿瘤细胞，由于患者个体差异较大，血液成分异常复杂，所含肿瘤细胞的比例也有很大差异，研究出一种普遍适用又高效的富集方法成为大家研究的热点。

肺癌患者化疗后的癌转移是影响患者生存的一个重要原因，目前有研究认为这种转移是由于患者体内还存在肺癌干细胞。如何识别、分离这些细胞，从而研究他们的遗传和蛋白上的变化，开发出针对性的药物成为将来研究的方向[10-11]。

越来越多的研究发现，肺癌患者存在致癌基因突变，且以一种互斥的方式存在，这些癌基因包括EGFR、Kras、ALK、MET等[12]。这些致癌基因的突变有些能预测小分子酪氨酸激酶抑制剂靶向疗法的疗效[13-14]。所以，在确定一种给药方案前，往往要同时检测几个基因的突变情况。本研究发现在Kras第12位密码子中存在4种突变，包括G12C、G12D、G12A、G12V，在第13位密码子中也存在2种突变，包括G13D、Q61H，这些不同的突变对药物的疗效是否有不同的影响，虽然已经有些研究[15]，但还需要更多证据的支持。

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Analysis of K-ras gene mutation in 358 cases of lung cancer

LuLiqin1,LiGang2△

(1.DepartmentofOncology,ZhejiangProvincialPeople′sHospital,Hangzhou,Zhejiang310014,China;2.Department

ofOncology,MinhangBranchHospital,AffiliatedTumorHospitalofFudanUniversity,Shanghai201100,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the mutation situation of K-ras gene in 358 cases of lung cancer to provide the guidance for the personalized therapy of lung cancer.MethodsThe nested and low denatured temperature compound PCR(COLD-PCR) method was used to analyze the K-ras mutations situation in 358 patients with lung cancer.ResultsIn 358 lung cancer patients,the total mutation frequency of K-ras gene was 8.10%.The mutation rates were 2.13% in 94 plasma samples,9.60% in 250 tumor tissue samples and 7.14% in 14 pleural and ascites samples.The mutation types included G12C,G12D,G12A,G12V,G13D and Q61H,the mutation rate had no statistical difference among 3 kinds of samples (P=0.064 8);the mutation rate was 6.96% in male patients and 8.59% in female patients,the difference was not statistically significant(P=0.574 0);the mutation rates were 4.76% in the patients aged 30-<45 years old,5.34% in the patients aged 45-<60 years old and 9.22% in the patients aged ≥60 years old,the differences were not statistically significant (P=0.250 3).ConclusionThe mutation types of K-ras gene are mainly G12C,G12D,G12V and G13D.The mutation rate of K-ras gene has no significant differences among different types of sample,different genders and different ages.

Key words:lung cancer;K-ras;gene mutation status

(收稿日期：2015-09-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.013

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)03-0321-03

作者简介：卢丽琴，女，主任医师，主要从事肿瘤治疗方面的研究。△通讯作者，E-mail:13391071510@163.com。