深圳地区2003～2014年献血者HIV血液筛查结果及其窗口期确认*

王　霞，许晓绚，吴桂丹，曾劲峰，杜　鹏，庄乃保

(深圳市血液中心，广东深圳 518035)



·论著·

深圳地区2003～2014年献血者HIV血液筛查结果及其窗口期确认*

王霞，许晓绚，吴桂丹，曾劲峰，杜鹏，庄乃保

(深圳市血液中心，广东深圳 518035)

摘要:目的分析深圳地区2003～2014年无偿献血者HIV感染率变化趋势，以及研究HIV感染窗口期确认过程。方法2003～2014年共584 111例献血者经进口与国产2种ELISA试剂及血液病毒核酸(NAT)检测方法(2006年开始使用)筛查HIV项目，抗-HIV阳性样品送疾病预防控制中心(CDC)确证，统计分析12年来献血者HIV感染流行趋势。另外，使用高灵敏度的荧光定量-PCR(Rt-PCR)方法对抗-HIV阴性/NAT阳性样品确认HIV RNA的存在并随访跟踪复查，以判定是否为HIV感染窗口期。结果深圳地区2003～2014年献血人数逐年增长，抗-HIV筛查阳性率呈平稳下降趋势，但经CDC确认为HIV感染的献血者流行率则急剧升高，2014年的献血者HIV感染率为2003年的26.61倍；感染HIV的献血者中由同性性行为传播的比例逐年升高。通过跟踪复查、Rt-PCR检测，4例抗-HIV阴性/NAT阳性样品为HIV感染窗口期，深圳地区无偿献血者的HIV感染窗口期检出率为1/117 995(4/471 978)。无偿献血者HIV感染率在男性组、18～<39岁组、已婚组、初次献血组分别明显高于女性组、39～<60岁组、未婚组、重复献血组(P<0.05)，而非该地与该地户籍组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论深圳地区的血液筛查机制与手段能较好地杜绝HIV感染窗口期带来的输血风险，有效保障输血安全。

关键词:无偿献血者；人类免疫缺陷病毒；病毒核酸检测；荧光定量聚合酶链反应；窗口期

随着分子生物学技术的发展及其在血液筛查检测方面的应用，血液病毒核酸检测(NAT)技术已能大大降低经输血传播病毒的风险[1-2]。相关研究显示，乙型肝炎、丙型肝炎、HIV病毒的血清学标志物检出时间上限分别为第30、65、19天，使用NAT技术能缩短至第10、2、3天[3-4]，可见NAT技术在乙型肝炎、丙型肝炎、HIV病毒感染的感染窗口期对血液筛查具有不可替代的作用，能最大限度地保障输血安全。深圳市血液中心于2006年正式把NAT检测作为血液筛查常规手段，作为全国第一批引进NAT检测的城市，经过8年的应用，已经获得详细的献血者血筛数据，本研究主要分析2003～2014年无偿献血者血液HIV的ELISA及NAT检测结果，并对抗-HIV阴性，NAT阳性献血者进行感染窗口期确认，以提供真实的献血者HIV感染流行率及HIV输血风险评估，为深圳地区的HIV传染防控提供数据参考。

1资料与方法

1.1一般资料深圳市2003年1月至2014年12月无偿献血者584 111例，年龄18～55岁。献血者在献血前经乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)快速试纸条、丙氨酸氨基转移酶(ALT)干化学检测初筛，合格者进行献血并留样送至检验科，使用ELISA及NAT方法筛查血站常规检测项目。

1.2仪器与试剂ELISA检测仪器：Microlab STAR全自动加样仪、Xantus-200全自动加样仪、Microlab FAME全自动ELISA分析系统、BEHRING(Ⅲ)ELISA处理系统、美国Biorad洗板机和Zenyth340rt恒温酶标仪等。NAT检测仪器：瑞士HIMILTON自动核酸提取仪、美国ABI核酸扩增检测仪、瑞士HIMILTON STAR2000全自动汇集仪、美国TIGRIS全自动血液NAT系统。HBsAg胶体金试纸由杭州艾博生物医药有限公司提供；ALT干化学初筛试纸条由美国罗氏公司提供；ALT速率法检测试剂盒由上海科华公司及澳斯邦生物公司提供；2003～2014年检测抗-HIV的ELISA试剂来自多个公司及厂家，包括北京万泰公司、珠海丽珠公司、荷兰梅里埃公司及美国Bio-Rad公司。2003～2012年的ELISA检测一直都是国产与进口2种试剂检测，到2013年初开始使用1次进口ELISA加NAT试剂检测。NAT试剂使用上海科华公司与美国诺华Procleix Ultrio assay NAT试剂。逆转录步骤使用TAKARA公司生产的PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，由大连宝生物工程公司提供，批号D6110A；实时荧光定量-PCR(Rt-PCR)使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒，由大连宝生物工程公司提供，批号DRR820A。Rt-PCR仪为美国安捷伦公司MX3005P型号。

1.3检测方法

1.3.1NAT检测2006～2009年使用上海科华公司生产的NAT检测产品，按照产品要求，为“8人汇集池+再拆分”的混检模式；2010年至今使用美国诺华公司的Procleix TIGRISNAT系统，为“三联病毒检测+可疑阳性鉴别”的单检模式。所有试验的操作均严格按照试剂盒说明书和《中国输血技术操作规程》相关要求进行，以上试剂均批检合格，不同批号试剂均在有效期内使用。

1.3.2血样HIV RNA提取使用罗氏诊断公司的High Pure Viral Nucleic Acid核酸提取试剂盒(德国曼海姆罗氏诊断公司，批号14765344)提取1 mL血浆RNA，按说明操作进行,使用去RNA酶的实验耗材，防止HIV RNA提取过程中降解。

1.3.3Rt-PCRRt-PCR定量鉴定HIV RNA采用两步法：RNA逆转录与cDNA定量PCR。上下游引物分别为：HIV-F 5′-TAA AGC TTG CCT TGA GTG CT-3′/HIV-R 5′-GTC TGA GGG ATC TCT AGT TAC CAG-3′,探针HIV-Probe 5′-(Hex) AGT AGT GTG TGC CCG TCT GTT GTG-(BHQ2)-3′。

1.3.4献血者HIV阳性确认本中心实验室筛查抗-HIV阳性和抗-HIV阳性/NAT阳性的标本送至深圳市疾病预防控制中心(CDC)进行确认。

1.3.5HIV窗口期献血者追踪对于抗-HIV阴性/NAT阳性献血者进行规律地追踪复查，复检项目包括抗-HIV、常规NAT及手工Rt-PCR确认。追踪数据理论上需要有1个月后的数据，但实际情况因献血者的流动性大等因素，可能存在缺少部分数据。

1.4统计学处理采用SPSS19.0统计软件进行数据处理及统计学分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验中的Fisher确切概率法，采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.12003～2014年献血者抗-HIV筛查结果深圳市血液中心从2003年开始献血人数呈逐年上升，直到2014年献血者数量比2003年增加将近1倍，达到68 423例。而2003～2014年抗-HIV的筛查阳性率总体呈下降趋势。2003～2006年抗-HIV阳性率为缓慢增长期，于2007年明显下降后，至2009年检测抗-HIV阳性率达到最高，为0.36%(161/44 413)，此后至2014年逐年降至最低，为0.19%(132/68 423)。2003～2014年抗-HIV检测总阳性率为0.25%(1 450/584 111)。见图1。

图1　　2003～2014年献血者抗-HIV初筛阳性率

2.22003～2014年确认感染HIV献血者情况本中心筛查结果为抗-HIV阳性的献血者标本通过本市CDC确认，结果显示与2003年相比，2014年的献血者HIV感染率呈急剧上升趋势(感染率由2003年的0.28/10 000上升到2014年的7.45/10 000，升高约26.61倍)；2003～2009年献血者HIV感染率平稳升高，于2010年急剧升高至4.77/10 000，在2010～2013年又处于平稳感染状态，最后至2014年出现新的HIV感染率飞跃，达到7.45/10 000。见图2。

图2　　2003～2014年献血者确认HIV感染率

2.32006～2014年献血者HIV感染窗口期情况及确认本中心从2006年正式把NAT检测作为血液筛查常规技术，通过统计完整的ELISA及NAT数据，2006～2014年共筛查出4例抗-HIV阴性/NAT阳性献血者，均为男性，25～40岁，成功追踪复查3例献血者，有2例仍处于抗-HIV阴性/HIV RNA阳性的窗口期感染状态，1例已经出现抗-HIV阳转/HIV RNA阳性，成为HIV显性感染状态；另有1例(4号)献血者因不配合追踪程序，通过本市CDC接受随访复查确认为HIV感染。故4例初筛为抗-HIV阴性/NAT阳性的献血者通过追踪及Rt-PCR确证HIV RNA存在，确认为HIV感染窗口期。见表1。

2.4不同特征献血者的HIV感染率比较无偿献血者HIV感染率在男性组、18～<39岁组、已婚组、初次献血组分别明显高于女性组、39～<60岁组、未婚组、重复献血组(P<0.05)，而非本地与本地户籍组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1　　4例抗-HIV阴性/NAT阳性献血者基本信息及追踪结果

*：CDC接受随访，确认感染。

表2　　2003～2014年总献血者HIV感染率在

3讨论

本文统计分析了深圳市血液中心2003～2014年无偿献血者HIV筛查及CDC确证HIV感染者的数据，旨在了解本市献血者人群12年来的HIV感染流行趋势，为无偿献血者招募提供基础数据。本中心使用ELISA方法初筛献血者抗-HIV的阳性率，在2003～2014年总体呈平稳下降趋势，只在2007年及2009年出现较大的变化波动，而在2012～2014年抗-HIV阳性率更趋于平稳。但实际上，经过CDC对抗-HIV阳性样品的确证，2003～2014年无偿献血者HIV感染率从0.28/10 000上升到7.45/10 000，增长26.61倍，与本中心实验室筛查抗-HIV阳性率总体下降的方向相反，这可能与本中心近年来所用筛查抗-HIV的试剂灵敏度与特异度增高，而抗-HIV假阳性率降低有关[5]。

图2示深圳地区2012～2014年的献血者确证HIV感染率为4.78/10 000～7.45/10 000，高于同期南京地区的1.10/10 000～2.10/10 000[6],2010～2013年的4.77/10 000～5.63/10 000高于同期广州地区的2.00/10 000～3.50/10 000[7],2010～2012年的4.77/10 000～5.63/10 000高于同期北京地区的2.11/10 000～3.94/10 000[8]，而在2003～2009年深圳地区献血人群HIV感染率为0.28/10 000～1.43/10 000，低于同期北京的0.54/10 000～1.74/10 000[8]，甚至低于其他地区[9]，可见深圳地区在2010年开始献血者人群的HIV流行率明显升高，是2009年的3.53倍(4.77∶1.35，图2)。据文献报道，2010年深圳地区CDC新确认HIV感染者及男男性行为献血者HIV相比上1年出现明显升高[10-12]，而献血者作为普通人群的组成部分，这可能为2010年开始献血者人群HIV感染率突然增长的原因之一。同样图2可见，2014年的献血者HIV感染率又一次出现飞跃性升高，是2013年的1.56倍(7.45∶4.78，图2)，查询本中心对HIV感染献血者的传播途径背景数据可发现，2009年HIV感染献血者有33.30%为同性传播，到2014年这一比例上升至65.30%，显示传染HIV的途径已偏向同性性行为，异性行为及吸毒注射传播比例逐渐下降，应引起有关部门的重视。无偿献血者是社会普通人群的组成部分，HIV感染献血者群体的病毒传播途径多数为同性性行为，也提示普通人群的主要HIV感染途径可能与之类似，故本数据可为CDC对HIV的预防策略提供借鉴。本中心通过酶免及核酸检测技术筛查出4例抗-HIV阴性/NAT阳性献血者，回访调查发现其中2例存在同性性行为，充分说明带着检测HIV动机的献血者风险性极高。通过随访跟踪、Rt-PCR技术确认HIV RNA存在及CDC进一步流调，可判定4例抗-HIV阴性/NAT阳性献血者是否为HIV感染窗口期，表1示样品1、2、3均成功追踪随访，使用血站常规NAT检测及Rt-PCR两种方法、不同扩增引物检测核酸，可确证HIV RNA的存在[13]，排除常规核酸检测假阳性结果。样品1、3完成1次追踪，结果仍为抗-HIV阴性/HIV RNA阳性，血清学抗体未转阳，仍处于感染窗口期；样品2于第2次追踪出现抗-HIV阳转/HIV RNA阳性，成为显性HIV感染者；样品4因献血者不配合追踪程序，CDC随访跟踪，后来确认为HIV感染者。故该4例献血者均判定为HIV感染窗口期，深圳地区2006～2014年无偿献血者HIV感染窗口期检出率为1/117 995(4/471 978)，高于韩国地区的1/1 080 244[14]及加拿大地区的1/8 000 000[15]。4例窗口期献血者均为男性，学历分布高低级阶段，3/4例未婚，本研究通过成熟的追踪回访机制，科学完成HIV窗口期的确认及献血者资料信息获得，充分体现本中心的NAT筛查手段与手工核酸扩增技术的重要作用，为降低血液潜在风险起到不可或缺作用，保障了输血安全。

表2分析了193例确认感染HIV的献血者在不同特征信息上的分布情况，可发现男性、18～<39岁、已婚及初次献血者组的HIV感染率高于其对立组(P<0.05)，这为献血前咨询预防HIV高危献血者提供基础依据。本研究主要价值在于，一是获得长达12年来的献血者HIV感染趋势，2014年献血者HIV感染率是2003年的26.61倍，有关部门应高度重视HIV传播问题，本数据对深圳地区人群HIV防控具有重要意义；二是建立手工扩增HIV RNA的高灵敏度Rt-PCR方法，同时展示了4例抗-HIV阴性/NAT阳性献血者的窗口期确认过程，为血液筛查中HCV、HBV窗口期的确证提供借鉴方法；另外，窗口期样品检出为后期输血风险评估提供支撑数据，充分肯定了NAT技术在血筛中保障输血安全的贡献。

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HIV blood screening results and its window period confirmation in blood donors in Shenzhen area during 2003-2014*

WangXia,XuXiaoxuan,WuGuidan,ZengJinfeng,DuPeng,ZhuangNaibao

(ShenzhenMunicipalBloodCenter,Shenzhen，Guangdong518035,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the change trend of HIV infection rate among volunteer donors in Shenzhen area during 2003-2014 and investigate the confirmation process of HIV window infection period.MethodsThe HIV screening items in 584 111 blood donors samples were performed by ELISA with both domestic and imported reagents and the viral nucleic acid (NAT) detection method (starting from 2006).The samples with anti-HIV positive were submitted to the center for disease control(CDC) for conducting the confirmation of HIV infection.The prevalent trend of HIV infection rate in blood donors was statistically analyzed.Moreover,the highly sensitive fluorescent quantitative method(Rt-PCR) was used to confirm the existence of HIV RNA in the samples with anti-HIV negative/ NAT test positive and the follow up was performed to conduct the retest for judging whether being the HIV window infection period.ResultsThe number of blood donors was increased year by year during 2003-2014 and the positive rate of anti-HIV screening demonstrated the steadily declining trend,but the prevalence rate of HIV infected donors confirmed by CDC was sharply increased,the HIV infection rate of blood donors in 2014 was 26.61 times of that in 2003,among them,the transmission proportion by homosexual behavior was elevated year by year.Through following up retest and Rt-PCR detection,4 samples of anti-HIV negative /NAT positive were finally identified as the window infection period,the detection rate of HIV window infection period in Shenzhen area was 1/117 995(4/471 978).The infection rate of HIV in the male group,18-<39 years old group,married group and first-time donor group among voluntary donors were significant higher than that in the female group,39-<60 years old group,unmarried group and re-donation group(P<0.05).However,there was no statistically significant difference between the locality census register group and local household registration group(P>0.05).ConclusionThe blood screening system and measures in Shenzhen area could better eradicate the blood transfusion risk brought by the HIV window infection period and effectively ensure the blood transfusion safety.

Key words:blood donors;human immunodeficiency virus;virus nucleic acid detection;fluorescence quantitative polymerase chain reaction;window period

(收稿日期：2015-10-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.005

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)03-0299-04

作者简介：王霞，女，主管护师，主要从事血液采集、质量控制与血液安全研究。

*基金项目：广东省医学科学技术研究基金项目(B2014358)。