鼠源性抗星形胶质细胞上调基因1单克隆荧光抗体在恶性浆膜腔积液检测中的应用*

路　蔓，龙　敏，刘　冲，陈　曦，王　琛，张惠中

(第四军医大学唐都医院临床实验与检验科，陕西西安 710038)



·论著·

鼠源性抗星形胶质细胞上调基因1单克隆荧光抗体在恶性浆膜腔积液检测中的应用*

路蔓，龙敏，刘冲，陈曦，王琛，张惠中

(第四军医大学唐都医院临床实验与检验科，陕西西安 710038)

摘要:目的应用鼠源性抗星形胶质细胞上调基因1(AEG-1)单克隆荧光抗体检测恶性浆膜腔积液中的肿瘤细胞。方法应用PCR及Western-blot方法检测浆膜腔积液脱落细胞中的AEG-1表达；用鼠源性抗AEG-1单克隆荧光抗体与恶性浆膜腔积液中的肿瘤细胞共孵育，同时采用良性病变的浆膜腔积液作为阴性对照。结果恶性浆膜腔积液脱落细胞中AEG-1表达呈阳性，而良性病变的浆膜腔积液脱落细胞中AEG-1表达为阴性或弱阳性；同时鼠源性抗AEG-1单克隆荧光抗体直接标记脱落细胞的结果与PCR和Western-blot检测结果一致。结论鼠源性抗AEG-1单克隆荧光抗体为浆膜腔积液中的肿瘤细胞鉴定提供了新的实验手段。

关键词:鼠源性抗星形胶质细胞上调基因1；单克隆抗体；荧光标记；浆膜腔积液

星形胶质细胞上调基因1(AEG-1)是近年来发现的新的癌基因，Emdada等[1]于2009年对其做了进一步证实。该基因位于与多种恶性肿瘤发生密切相关的人类8号染色体(8q22)上，进一步研究表明其是促进肿瘤发生、发展的一个关键因子[2-3]。相关研究表明，AEG-1基因与多种恶性肿瘤，如肝细胞癌、神经胶质瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌等的发生、发展密切相关[4]。另有研究表明,人AEG-1基因的启动子(-2710/+49)缺少TATA或CAAT盒，但含有多个Spl基序并富含GC序列，其中Spl基序可以与核因子-κB(NF-κB)相互作用，可能是AEG-1发挥功能的重要片段[5-6]。现已证实AEG-1是Ras/PI3K/Akt/c-Myc信号转导通路的下游靶分子，可以通过调控PI3K/Akt、NF-κB、Wnt/β-catenin、 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等多条信号途径参与正常细胞转化，肿瘤细胞增殖、侵袭、转移，血管生成等多个肿瘤发生、发展的环节，并能介导肿瘤细胞自噬活性和化疗耐药。该基因对多种恶性肿瘤的诊断和预后具有重要的临床意义，可能成为肿瘤治疗和抗癌药物研发的新靶点。本实验室前期通过杂交瘤技术获得1株能稳定分泌抗AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株(IE3)。本研究培养IE3细胞小鼠，腹腔内注射制备腹水，提取并纯化单克隆抗体，并用异硫氰酸荧光素(FITC)对单克隆抗体进行荧光标记。

1材料与方法

1.1标本来源收集临床确诊为恶性肿瘤，且常规中能查见大量异形有核细胞的浆膜腔积液，其中诊断为卵巢癌患者的腹水标本13份，诊断为肺癌并全身转移患者的胸腔积液标本17份。并收集良性病变的浆膜腔积液作为阴性对照，其中诊断为肝硬化患者的腹水标本22份，诊断为心力衰竭患者的胸腔积液标本8份。

1.2仪器与试剂2720型PCR仪由美国基因泰克工程技术公司提供，DYY-8C双稳定时电泳仪、DYCP-40C半干式碳板转移槽由北京六一生物科技有限公司提供，凝胶图像分析仪由美国阿尔法科技有限公司提供，UBR4型干浴器由Grant Brother公司提供，BCD-628WACW冰箱由海尔公司提供，超净工作台由富康公司提供，生化培养箱由重庆永生实验仪器厂提供。DNA标记物由西安润德公司生物技术有限公司提供；Protein标记物由美国Thermo scientific公司提供；山羊抗小鼠二抗由中山生物技术有限公司提供；FITC及二甲基亚砜(DMSO)由美国Sigma公司提供；RNAiso Plus及反转录试剂盒由日本TaKaRa公司提供；氯仿、异丙醇、75%乙醇由天津市津北精细化工有限公司提供。

1.3检测方法

1.3.1AEG-1蛋白检测收集胸腔积液及腹水细胞提取RNA，反转录为cDNA，PCR检测AEG-1。(1)收集浆膜腔积液中的细胞提取RNA。①将胸腔积液及腹水离心收集细胞，3 000 r/min离心10 min，弃上清。②收集细胞，移入1.5 mL离心管中，加入1 mL RNAiso Plus，混匀放置10 min。③加入200 μL氯仿，震荡混匀15 s以上，室温放置5 min，离心(4 ℃，14 000 r/min，10 min)。④离心后液体分层，上层无色液体含RNA，小心吸取上层无色液体移入新的1.5 mL离心管中。⑤加入等体积异丙醇，混匀，15～30 ℃下孵育10～30 min，离心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)。⑥去上清，沉淀加入75%乙醇1 mL，震荡30 s,离心(4 ℃，7 500 r/min，5 min)。⑦小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风干燥3～5 min。⑧加入20 μL焦磷酸二乙酯(DEPC)水溶液溶解沉淀。(2)将RNA反转录为cDNA。反转录20 μL体系为：提取细胞的RNA模板2 μL、5×prime script 4 μL、ddH2O 14 μL。PCR扩增:37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ ∞。(3) PCR检测AEG-1蛋白。Mix 20 μL体系为：2×Taq Mix 10 μL、ddH2O 8 μL、引物异黏蛋白(MTDH)1 μL、模板cDNA 1 μL。

1.3.2Western-blot检测细胞蛋白(1)收集浆膜腔积液中的脱落细胞提取蛋白。①将胸腔积液及腹水离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液清洗一遍。②加入200 μL细胞裂解液、2 μL DMSO，4 ℃摇床30 min裂解细胞。③离心(4 ℃，14 000 r/min，15 min)，取上清。(2)Western-blot检测细胞蛋白。将浆膜腔积液细胞裂解蛋白上样，用纯化后的抗AEG-1单克隆抗体作为一抗(1∶500稀释)，用山羊抗小鼠作为二抗(1∶5 000稀释)。

1.3.3鼠源性抗AEG-1单克隆荧光抗体检测恶性浆膜腔积液中的肿瘤细胞(1)取新鲜抽取的浆膜腔积液1 mL，加入2 μL鼠源性抗AEG-1单克隆荧光抗体(1∶500稀释)。(2)37 ℃避光摇床100 r/min反应30 min。(3)用磷酸盐缓冲液离心(1 200 r/min，5 min)清洗3遍，除去未结合上的荧光单克隆抗体。(4)压片，荧光显微镜镜检。

2结果

2.1病理科脱落细胞检测卵巢癌及肺癌患者浆膜腔积液的脱落细胞中查见肿瘤细胞。

2.2PCR检测AEG-1表达收集浆膜腔积液中的细胞提取RNA，反转录为cDNA，PCR检测AEG-1，见图1。恶性浆膜腔积液脱落细胞中AEG-1呈阳性，而良性病变的浆膜腔积液脱落细胞中AEG-1呈阴性或弱阳性。

1、6：肝硬化腹水β-actin、AEG-1结果；2、7：心力衰竭胸腔积液β-actin、AEG-1结果；3、8：卵巢癌腹水β-actin、AEG-1结果；4、9：肺癌胸腔积液β-actin、AEG-1结果；M:蛋白标记物。

图1PCR检测AEG-1表达

2.3Western-blot检测浆膜腔积液细胞AEG-1表达细胞蛋白检测结果见图2。恶性浆膜腔积液脱落细胞中AEG-1呈阳性，而良性病变的浆膜腔积液脱落细胞中AEG-1呈阴性或弱阳性，与PCR的检测结果一致。

1:肝硬化腹水细胞裂解蛋白；2:心力衰竭胸腔积液细胞裂解蛋白；3:卵巢癌腹水细胞裂解蛋白；4:肺癌胸腔积液细胞裂解蛋白；B：对应4种细胞的β-actin结果。

图2Western-blot检测细胞蛋白

2.4浆膜腔积液中的异形有核细胞鼠源性抗AEG-1单克隆荧光抗体检测浆膜腔积液中的异形有核细胞结果见图3～4(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。在恶性浆膜腔积液中，FITC标记的抗AEG-1单克隆抗体可与脱落的肿瘤细胞膜表面的AEG-1特异性结合，而在良性病变的浆膜腔积液中呈阴性。抗AEG-1单克隆荧光抗体直接标记脱落细胞的结果与PCR和Western-blot检测结果一致。

3讨论

AEG-1是近年来发现的新的癌基因。到目前为止的恶性肿瘤研究中，AEG-1表达于多种相关组织恶性肿瘤，包括肝细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、食管鳞状细胞癌(ESSC)、黑色素瘤、多形性胶质瘤(GBM)等，但其在正常组织和良性病变中表达不明显[7-11]。对比分析癌组织和良性病变组织，已经确定AEG-1是一项潜在的诊断癌症及判断预后的指标。浆膜腔积液是在疾病情况下，胸腔、腹腔或心包腔内集聚的过多液体的总称，是一种常见的临床现象。最常见病因为恶性肿瘤(31.3%)，其次为结缔组织疾病、结核、肝硬化、心功能不全等。由于AEG-1是一个在大多数恶性肿瘤中均表达的基础性癌基因，因此检测脱落细胞的AEG-1即可辨别浆膜腔积液的性质，且具有很高的特异度。

杂交瘤技术是将经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞(SP-20)在体外融合在一起，融合后的杂交瘤细胞兼有骨髓瘤细胞无限繁殖和脾细胞分泌抗体的能力。这种细胞通过克隆化即可成为单克隆系，能产生大量针对同一抗原决定簇的抗体，这种抗体就称为单克隆抗体。与多克隆抗体相比，单克隆抗体的特点是理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强，性质稳定，且便于人为处理和质量控制，这些优点使它一问世就受到高度重视。目前为止，人们已经研究出各种单克隆抗体，其应用已经涉及医学、食品、农业、卫生、环境等众多领域，单抗药物的开发已经成为生物医学的新热点。单克隆抗体广泛用于基础研究，疾病的诊断治疗、预防，环境与食品卫生的检测，提纯蛋白，优生优育，而且随着单克隆抗体技术的发展，将出现更加广阔的前景。

本研究将鼠源性抗AEG-1单克隆抗体FITC标记可放大信号，有利于临床检测。在恶性浆膜腔积液中，FITC标记的抗AEG-1单克隆抗体可与脱落的肿瘤细胞膜表面的AEG-1特异性结合，而在良性病变的积液中呈阴性，结

果提示，该荧光标记抗体具有肿瘤特异性，可为临床恶性浆膜腔积液的早期诊断提供一定的理论基础。

参考文献

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Application of mouse anti AEG-1 monoclonal fluorescent antibody in malignant serous cavity effusions*

LuMan,LongMin,LiuChong,ChenXi,WangChen,ZhangHuizhong

(DepartmentofClinicalExperimentandLaboratory,TangduHospitalofFourth

MilitaryMedicalUniversity,Xi′an,Shaanxi710038,China)

Abstract:ObjectiveTo use mouse astrocytes elevated gene-1(AEG-1) monoclonal fluorescent antibody for detecting tumor cells in malignant serous cavity effusions.MethodsThe expression of AEG-1 in serous cavity effusion exfoliated cells by PCR and Western-blot;the mouse monoclonal anti-AEG-1 fluorescent antibody and tumor cells in malignant serous cavity effusions were co-incubated,meanwhile，the serous cavity effusions in benign lesions were taken as the negative control.ResultsThe AEG-1 expression was positive in malignant serous cavity effusions exfoliated cells,while which in benign lesion serous cavity effusion was negative or weakly positive;meanwhile the results of direct labelling in mouse anti AEG-1 monoclonal antibodies were consistent with the results by PCR and Western-blot.ConclusionMouse anti AEG-1 monoclonal fluorescence antibody can provide certain theoretical basis for the detection of tumor cells in serous cavity effusion.

Key words:mouse astrocytes elevated gene-1;monoclonal antibodies;fluorescently labeling;effusion

(收稿日期：2015-09-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.03.001

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)03-0289-03

作者简介：路蔓，女，主管检验师，主要从事临床检验基础研究。

*基金项目：国家自然科学基金项目(81201525)。