糖尿病与氧化应激在颈动脉粥样硬化大鼠内皮功能障碍中的作用研究

盛冲霄，黎红华，崔 敏，汪志忠，李 敏

·论著 ·

糖尿病与氧化应激在颈动脉粥样硬化大鼠内皮功能障碍中的作用研究

盛冲霄，黎红华，崔 敏，汪志忠，李 敏

目的 探讨糖尿病与氧化应激在颈动脉粥样硬化(CAS)大鼠内皮功能障碍中的作用。方法 2014年6—10月选取SPF级健康雄性Wistar大鼠30只，采用随机数字表法分为对照组、CAS组、糖尿病CAS组，每组10只。CAS组、糖尿病CAS组大鼠给予高脂饲料喂养结合维生素D3注射液60万U/kg一次性腹腔注射建立CAS模型。糖尿病CAS组大鼠第5周时给予链脲佐菌素(STZ)45 mg/kg腹腔注射建立糖尿病模型。对照组大鼠给予基础饲料喂养结合0.9%氯化钠溶液腹腔注射。15周后处死大鼠，分离颈动脉，截取约3 mm新鲜颈动脉环，HV-4离体组织器官恒温灌流系统中加入不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)乙酰胆碱，记录颈动脉环张力(最大舒张度)。苏木素-伊红(HE)染色观察颈动脉组织，免疫组织化学SP法染色并检测颈动脉亲环素A(CyPA)、Kruppel样转录因子2(KLF2)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)平均光密度。结果 HV-4离体组织器官恒温灌流系统中加入不同浓度乙酰胆碱后各组大鼠颈动脉环均出现舒张反应。CAS组、糖尿病CAS组大鼠10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L乙酰胆碱颈动脉环张力较对照组降低(P<0.05)；糖尿病CAS组大鼠10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L乙酰胆碱颈动脉环张力较CAS组降低(P<0.05)。HE染色示对照组大鼠颈动脉内膜完整光滑，内皮细胞以及平滑肌细胞排列整齐，无增生；弹性纤维连续无中断。CAS组、糖尿病CAS组大鼠颈动脉可见内膜断裂，中层钙化斑块形成，弹性层失去连续性。CAS组、糖尿病CAS组大鼠颈动脉CyPA平均光密度较对照组升高，KLF2、eNOS平均光密度较对照组降低(P<0.05)；糖尿病CAS组大鼠颈动脉CyPA平均光密度较CAS组升高，KLF2平均光密度较CAS组降低(P<0.05)。结论 糖尿病与氧化应激参与了CAS大鼠内皮功能功能障碍的形成，其机制可能与CyPA表达水平增加有关。

颈动脉疾病；糖尿病；氧化应激；内皮功能障碍；亲环素A

盛冲霄，黎红华，崔敏，等.糖尿病与氧化应激在颈动脉粥样硬化大鼠内皮功能障碍中的作用研究[J].中国全科医学，2016，19(9)：1015-1020.[www.chinagp.net]

Sheng CX，Li HH,Cui M,et al.Impact of diabetes and oxidative stress on endothelial dysfunction of carotid atherosclerosis rats[J].Chinese General Practice，2016，19(9)：1015-1020.

据报道，20%～30%的缺血性脑卒中与颈动脉粥样硬化(carotid atherosclerosis，CAS)血管狭窄相关[1]。糖尿病作为CAS的重要危险因素，其导致CAS的机制一直是研究的热点。目前研究证实,高血糖与氧化应激相互作用参与了CAS的发生发展[2]。而内皮功能障碍是动脉粥样硬化(AS)的起始环节。氧化应激是指机体氧化与抗氧化能力失衡，活性氧(reactive oxygen species，ROS)在体内蓄积导致组织细胞损伤的病理过程[3]。氧化应激贯穿了糖尿病AS过程的始终[2]。亲环素A(cyclophilin A，CyPA)被认为是重要的氧化应激诱导因子，可在氧化应激刺激下由内皮细胞、血管平滑肌细胞分泌[4]。有研究证实了急性冠脉综合征(acute coronary syndromes,ACS)患者血清CyPA水平明显高于稳定性心绞痛和正常对照组患者[5]。本研究通过观察糖尿病CAS大鼠颈动脉内皮依赖性舒张功能以及颈动脉CyPA、Kruppel样转录因子2(Kruppel-like factor 2,KLF2)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表达，探讨糖尿病与氧化应激在CAS大鼠内皮功能障碍中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 2014年6—10月选取SPF级健康雄性Wistar大鼠30只，6周龄，体质量180～200 g，由湖北省实验动物研究中心提供，分笼饲养在武汉大学动物实验中心SPF环境中，室内温度(22±1)℃,湿度(60±10)%,自由进食水,光照12 h明暗交替。

1.1.2 主要实验药剂 维生素D3注射液(上海通用药业股份有限公司，批号：20121002)；胆固醇、胆酸钠(武汉凯润成生物工程有限公司)；兔抗CyPA、KLF2、eNOS抗体(北京索莱宝生物科技有限公司)；免疫组织化学SP试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(北京索莱宝生物科技有限公司，批号：S0130)；基础饲料由武汉大学动物实验中心提供，高脂饲料(81.3%普通饲料、5.0%蔗糖、10.0%猪油、3.0%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶)由武汉市万千佳兴生物科技有限公司加工。

1.1.3 主要仪器 BL-420S生物机能实验系统、HV-4离体组织器官恒温灌流系统、JH-2型张力换能器(成都泰盟科技有限公司)，YB-6型生物组织包埋机(湖北孝感市亚光医用电子技术研究所)，RM2016型Leica石蜡切片机(德国Leica公司)，OLYMPUS BX51照相显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 分组 所有大鼠经适应性喂养3 d后采用随机数字表法分为3组，对照组10只、CAS组10只、糖尿病CAS组10只。3组大鼠体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1 3组大鼠体质量比较

注：CAS=颈动脉粥样硬化

1.3 造模方法 CAS造模方法参考文献[6]，CAS组、糖尿病CAS组大鼠给予高脂饲料喂养结合维生素D3注射液60万U/kg一次性腹腔注射。糖尿病造模参考文献[7]，糖尿病CAS组大鼠在CAS造模基础上，第5周禁食水12 h后给予1%STZ溶液45 mg/kg(以0.1 mol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制成1%STZ溶液)一次性腹腔注射，在腹腔注射72 h以及10 d后剪尾测血糖，空腹血糖均≥16.7 mmol/L，提示造模成功。CAS组大鼠第5周禁食水12 h后给予等量0.9%氯化钠溶液一次性腹腔注射。对照组大鼠给予基础饲料喂养结合等量0.9%氯化钠溶液一次性腹腔注射，第5周禁食水12 h后给予等量0.9%氯化钠溶液一次性腹腔注射。

1.4 取材 15周后过量水合氯醛麻醉处死大鼠，快速分离双侧颈动脉，剔除周围组织。

1.5 颈动脉环张力测定 每条颈动脉截取约3 mm颈动脉环连接到JH-2型张力换能器，置于含Krebs液的HV-4离体组织器官恒温灌流系统，给予2×g张力负荷，通入95%O2和5%CO2的混合气体，在37 ℃水浴中平衡1 h。以10-6mol/L去甲肾上腺素预刺激颈动脉环，张力达到平衡后加入不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)乙酰胆碱,记录每一浓度下颈动脉环张力(最大舒张度),绘制浓度反应曲线。

1.6 苏木素-伊红(HE)染色 新鲜颈动脉以4%多聚甲醛固定48 h后，行石蜡包埋，切片(横切，片厚2 μm)，按照HE染色步骤染色，置于400倍光镜下观察并摄片。

1.7 免疫组织化学SP法染色与数据采集 石蜡切片按照免疫组织化学SP法步骤进行染色。每张切片随机抽取3个不同的400倍视野。采用Image-Pro Plus 6.0软件对免疫组织化学结果进行分析，测定CyPA、KLF2、eNOS平均光密度(平均光密度=累积光密度/测量区域面积)。

2 结果

2.1 颈动脉环张力 HV-4离体组织器官恒温灌流系统中加入不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)乙酰胆碱后各组大鼠颈动脉环均出现舒张反应。3组大鼠不同浓度乙酰胆碱颈动脉环张力比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中CAS组、糖尿病CAS组大鼠10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L乙酰胆碱颈动脉环张力较对照组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；糖尿病CAS组大鼠10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L乙酰胆碱颈动脉环张力较CAS组降低，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2、图1)。

2.2 HE染色结果 光镜下，对照组大鼠颈动脉内膜完整光滑，内皮细胞以及平滑肌细胞排列整齐、无增生，弹性纤维连续无中断(见图2A，本文图2～5彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。CAS组、糖尿病CAS组大鼠颈动脉可见内膜断裂，中层钙化斑块形成，弹性层失去连续性(见图2B、2C)。

注：CAS=颈动脉粥样硬化

图1 3组大鼠不同浓度乙酰胆碱颈动脉环张力

Figure 1 Carotid artery ring tension of the three groups when given different concentrations of acetylcholine

2.3 颈动脉免疫组织化学SP法染色及CyPA、KLF2、eNOS平均光密度 光镜下观察3组大鼠颈动脉CyPA、KLF2、eNOS免疫组织化学SP法染色，可见其在各组大鼠颈动脉均有不同程度的表达(见图3～5)。3组大鼠颈动脉CyPA、KLF2、eNOS平均光密度比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中CAS组、糖尿病CAS组大鼠颈动脉CyPA平均光密度较对照组升高，KLF2、eNOS平均光密度较对照组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；糖尿病CAS组大鼠颈动脉CyPA平均光密度较CAS组升高，KLF2平均光密度较CAS组降低，差异均有统计学意义(P<0.05，见表3)。

Table 3 Comparison of the average optical density of CyPA,KLF2 and eNOS among the three groups

组别只数CyPAKLF2eNOS对照组1000035±0001100932±0033100358±00185CAS组1001096±00199a00205±00052a00045±00013a糖尿病CAS组1001243±00258ab00011±00003ab00013±00006aF值684052745849P值<001<001<001

注：CyPA=亲环素A，KLF2=Kruppel样转录因子2，eNOS=内皮型一氧化氮合酶；与对照组比较，aP<0.05；与CAS组比较，bP<0.05

表2 3组大鼠不同浓度乙酰胆碱颈动脉环张力比较±s，%)

注：与对照组比较，aP<0.05；与CAS组比较，bP<0.05

注：A为对照组，B为CAS组，C为糖尿病CAS组

图2 3组大鼠颈动脉切片(HE染色，×400)

Figure 2 Carotid artery sections of the three groups

注：A为对照组，B为CAS组，C为糖尿病CAS组

图3 3组大鼠颈动脉CyPA免疫组织化学SP法染色结果(×400)

Figure 3 Immunohistochemistry SP method staining results of CyPA of the three groups

注：A为对照组，B为CAS组，C为糖尿病CAS组

图4 3组大鼠颈动脉KLF2免疫组织化学SP法染色结果(×400)

Figure 4 Immunohistochemistry SP method staining results of KLF2 of the three groups

注：A为对照组，B为CAS组，C为糖尿病CAS组

图5 3组大鼠颈动脉eNOS免疫组织化学SP法染色结果(×400)

Figure 5 Immunohistochemistry SP method staining results of eNOS of the three groups

3 讨论

目前国内外对于CyPA的研究主要集中于其与氧化应激之间的关系，而对于CyPA导致内皮功能障碍的可能途径及高血糖对其产生的影响尚未见报道，本研究探讨了 CyPA与其下游信号分子KLF2、eNOS在CAS形成过程中的可能途径，研究了糖尿病对CAS以及CyPA的影响，在国内同类研究中有其创新之处。

Brownlee[8]提出糖尿病统一机制学说：氧化应激由始至终贯穿于糖尿病的发病过程，也是糖尿病并发症发病机制的共同基础。Paneni等[9]指出，高血糖触发的ROS积聚，与血管舒张因子一氧化氮(nitric oxide，NO)之间的失衡是引起内皮功能障碍的关键。内皮功能障碍是AS的起始环节。

CyPA属于亲免蛋白家族，在细胞内信号传导、蛋白活性的调节等方面具有重要作用。除了其细胞内功能，CyPA作为一种氧化应激诱导因子，在心血管疾病中具有生理以及病理作用，成为心血管疾病的一种潜在的生物标志物以及中介产物，如血管狭窄以及腹主动脉瘤[10]。在ROS的刺激下，内皮细胞以及血管平滑肌细胞分泌CyPA，分泌的细胞外CyPA又可刺激血管平滑肌细胞中细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、Akt和JAK等信号转导通路,进一步参与ROS产物的生成[10]。细胞内外的CyPA通过促进内皮细胞凋亡、内皮细胞表达白细胞黏附分子及血管平滑肌细胞增殖等机制参与AS的发生发展[10]。糖尿病以代谢紊乱为特征，在糖尿病中，高血糖以及升高的ROS促进单核细胞通过囊泡的形式分泌CyPA，而CyPA是糖尿病血管病变一个潜在的筛选标志物[11]。临床研究也证实,糖尿病合并冠状动脉疾病的患者血清CyPA水平明显高于健康志愿者[11]。

KLF2是近年新发现的转录因子，具有抗炎、抗凝、抗黏附、抗氧化的调控作用[12]，是一种重要的AS保护因子[13]。有报道指出，KLF2在成年大鼠血管中发挥内皮屏障功能，其可通过MEK5/细胞外信号调节激酶5(ERK5)/MEF2信号转导通路促进eNOS表达[14]。eNOS利用L-精氨酸(L-Arg)作为基质，在四氢生物蝶呤调节下合成NO[15]，后者通过NO/环磷酸鸟苷(cGMP)信号转导通路介导内皮依赖的血管舒张功能，是强大的血管舒张因子[16]。eNOS在血管张力调节以及维持内皮完整中起重要作用[17]。Nigro等[4]通过培养人脐静脉内皮细胞发现，CyPA可抑制KLF2表达，从而导致eNOS mRNA表达水平下降。

本研究结果显示，对照组大鼠颈动脉环张力良好，最大达(93.46±2.80)%，颈动脉内膜完整光滑，内皮细胞以及平滑肌细胞排列整齐、无增生，CyPA平均光密度较低，KLF2、eNOS平均光密度较高；而CAS组、糖尿病CAS组大鼠颈动脉环张力明显下降，颈动脉结构破坏严重，出现钙化斑块，深达中层，CyPA平均光密度升高，KLF2、eNOS平均光密度下降，其中糖尿病CAS组大鼠颈动脉在颈动脉环张力以及CyPA、KLF2、eNOS平均光密度等方面的变化尤为显著。表明了糖尿病CAS大鼠体内升高的氧化应激水平，糖尿病与氧化应激促进了CAS大鼠颈动脉内皮功能障碍，其机制可能与CyPA水平升高有关。本实验亦有不足之处，免疫组织化学光密度检测有其局限性，下一步本课题组将尝试更客观的分子生物学检测手段进一步论证本实验结果。

作者贡献：盛冲霄、崔敏、李敏进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；盛冲霄、汪志忠、李敏进行实验实施、评估、资料收集；黎红华进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

Impact of Diabetes and Oxidative Stress on Endothelial Dysfunction of Carotid Atherosclerosis Rats

SHENGChong-xiao，LIHong-hua,CUIMin,etal.DepartmentofNeurology,WuhanGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryAreaCommand,Wuhan430070,China

Objective To observe the impact of diabetes and oxidative stress on endothelial dysfunction of carotid atherosclerosis(CAS) rats.Methods From June to October in 2014,30 healthy male SPF-grade Wistar rats were divided into control group,CAS group and diabetic CAS group with 10 rats in each group by random table method.CAS group and diabetic CAS group were given intraperitoneal injection of a single dose of Vitamin D3by 600,000 U per kg body weight with high-fat diet.In the fifth week，diabetic CAS group was given intraperitoneal injection of a dose of Streptozocin by 45 mg per kg body weight.Control group was fed with basic diet.After 15 weeks,the rats were sacrificed,and 3 mm fresh carotid arterial ring was sectioned from each of the separated carotid arteries.The carotid artery ring tension was measured by adding different concentrations of acetylcholine (10-9，10-8，10-7，10-6，10-5and 10-4mol/L) into HV-4 out body tissue organ constant temperature perfusion system.Carotid artery tissue was observed by Hematoxylin and Eosin staining, and the average optical density of CyPA,KLF2 and eNOS was measured by immunohistochemistry SP method.Results After the addition of different concentrations of acetylcholine into HV-4 out body tissue organ constant temperature perfusion system,the carotid arterial rings of all the three groups had relaxant responses.CAS group and diabetic CAS group were lower than control group in carotid arterial ring tension when acetylcholine was given by 10-9，10-8，10-7，10-6，10-5and 10-4mol/L (P<0.05).Diabetic CAS group was lower than CAS group in carotid arterial ring tension when acetylcholine was given by 10-8，10-7,10-6,10-5and 10-4mol/L(P<0.05).HE staining showed that carotid artery intima of control group was complete and smooth with endothelial cells and smooth muscle cells in alignment,elastic fibers continuous without breakoff,and no hyperplasia. In CAS group and diabetic CAS group,intima breakage,formation of medial calcification plaques and loss of elastic layer continuity were observed. CAS group and diabetic CAS group were higher in the average optical density of CyPA and lower in the average optical density of KLF2 and eNOS than control group (P<0.05).Diabetic CAS group was higher in the average optical density of CyPA and lower in the average optical density of KLF2 than CAS group (P<0.05).Conclusion Diabetes and oxidative stress participate in the formation of endothelial dysfunction of CAS rats,and the mechanism may be related with the increase of CyPA expression.

Carotid artery diseases；Diabetes mellitus；Oxidative stress；Endothelial dysfunction；Cyclophilin A

湖北省自然科学基金资助项目(2013CFB428)

430070湖北省武汉市，广州军区武汉总医院神经内科

黎红华，430070湖北省武汉市，广州军区武汉总医院神经内科；E-mail：Lihonghua567@aliyun.com

R 743.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.09.006

2015-09-24；

2016-01-16)