三裂叶豚草霜霉病的病原鉴定及生物学特性研究

孙晓东，吕国忠，赵志慧 ，杨　红，刘绍芹，苏　丹

(1.大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连116605; 2.黑龙江八一农垦大学

会计学院，黑龙江 大庆 163319)



三裂叶豚草霜霉病的病原鉴定及生物学特性研究

孙晓东1，吕国忠1，赵志慧1，杨红1，刘绍芹2，苏丹1

(1.大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连116605; 2.黑龙江八一农垦大学

会计学院，黑龙江 大庆 163319)

摘要：对霜霉菌的生物学特性进行了系统研究。结果表明：该菌的孢子囊萌发的适宜温度为15～20℃，最适温度18℃；孢子囊萌发需较高的湿度，湿度低于95 %时孢子囊不萌发；可溶性淀粉对孢子囊的萌发有强烈的促进作用，用可溶性淀粉溶液处理孢子囊3 h后，其萌发率由原来的37.7 %提高到90.9 %；低温处理孢子囊，会降低霜霉菌孢子囊的萌发力，处理时间越长，孢子囊的萌发力越低。恒温条件下，在10～20℃范围内随着温度的升高，霜霉菌侵染能力增强；保湿时间低于2 h，霜霉菌不能侵染豚草，说明湿度条件是影响三裂叶豚草发病与否的重要因素。

关键词：三裂叶豚草；苍耳轴霜霉；生物学特性

Research on Pathogen Identification and Biological Characteristics of

三裂叶豚草(A.trifidaL.)是重要的外来入侵杂草，素有“植物杀手”之称[1]，已对中国的农业生产和生态环境造成了巨大威胁和危害，其产生的大量花粉是人类重要的过敏源[2]，严重危害了人类健康。为研究三裂叶豚草霜霉病在东三省的发生情况，对该地区进行了调查，发现铁岭、沈阳、鞍山、大连、丹东等地此病发生严重，且发病面积广。目前对三裂叶豚草的防治包括人工防除、化学防除、植物替代控制等方法，但由于豚草种子产生量大，蔓延迅速，上述方法都无法彻底根除。近年来，通过大量的野外调查发现，三裂叶豚草上普遍发生霜霉病，这类病害对三裂叶豚草表现了很强的致病性和致死性，为此，利用专性寄生菌来防治三裂叶豚草已经提上了日程。本研究对霜霉病菌的形态学特征及生物学特性进行了深入研究，为利用霜霉菌防治三裂叶豚草提供初步的理论依据。

1病原的鉴定

1.1　病菌来源

在三裂叶豚草生长季节(6-9月)进行病害调查，并在霜霉病多发的铁岭、沈阳、鞍山、大连、丹东等地区采集发病豚草样品。采用直接观察法，或者刮取叶背面较厚的霉层，用光学显微镜观察霜霉菌的形态特征，测量其孢子囊、孢囊梗大小，根据《中国真菌志》第六卷(霜霉目)及寄主范围进行鉴定[3]。

1.2　卵孢子观察

在进行霜霉菌卵孢子观察时，将干标本用清水浸湿，用打孔器在三裂叶豚草霜霉病斑处打取圆片，分别采用NaOH透明法、乳酚油透明法[4]和改良方法进行观察[5]。结果以改良方法观察到的细胞壁与其内含物界线清晰可见(如图1)。

改良方法：取三裂叶豚草霜霉病叶圆片多片置于烧杯中，用10 %NaOH溶液煮沸5～7 min，煮至豚草叶片透明，但尚未消解为止，用清水涮洗2～3次，加酸性品红染色(若卵孢子逸出可染色1～2 min，否则时间可稍加长)，用乳酚油作浮载剂进行镜检。

1.3　病原菌形态鉴定

经光学显微镜和扫描电镜观察，发现该病菌孢囊梗常具隔膜，无色，全长167.5～515 μm(平均374.3 μm)，主轴长140～362.5 μm(平均255.8 μm)，占全长的3/5～5/6，宽度4.2～10 μm(平均6.3 μm)，基部略膨大，上部近直角单轴分枝3～5 次，末枝直或略弯曲，圆锥形，常2～3枝簇生，长3.3～6.5 μm(平均5.1 μm)，顶端钝平。孢子囊卵形至椭圆形，基部有短柄，无色，具浅乳突，长12.2～15.6 μm(平均14.3 μm), 宽 8.8～11.9 μm(平均10.4 μm), 长∶宽=1.375。卵孢子生于病叶组织内，球形或近球形，淡黄色，直径22.5～40 μm(平均28.2 μm)，壁厚2.5～4(平均2.9 μm)(如图1)，初步鉴定该菌为苍耳轴霜霉(PlasmoparaangustiterminalisNovotelnova)。

图1　苍耳轴霜霉的孢囊梗、孢子囊及卵孢子

2三裂叶豚草霜霉病菌生物学特性测定与分析

2.1　温度对孢子囊萌发的影响

用蒸馏水配制新鲜孢子囊悬浮液，采用悬滴法培养，分别置于5，10，15，20，25℃下处理，每隔0.5 h室温(18～21℃)下镜检各处理的孢子囊萌发率，统计3，6，9，12 h后的萌发率。每项测定重复3次，每重复观察不少于200个孢子囊(以下同)。结果见表1。

结果表明：孢子囊在0～30℃都能萌发，其中适宜温度为15～20℃，最适温度为18℃且在最适温度下2 h即可萌发，12 h时萌发率达85.6 %，24 h基本全部萌发。在其适宜萌发的温度范围之外，12 h后孢子囊萌发率增幅缓慢。

表1　不同温度下孢子囊的萌发率　%

2.2　湿度对孢子囊萌发的影响

在干燥器内用硫酸法控制湿度。将叶片背面的新鲜孢子囊弹撒在载玻片上，每次处理8个载玻片。置于相对湿度分别为100 %、98 % 、95 %、90 %、85 %、80 % 的干燥器中， 18℃培养。3，6，9，12 h后分别取出2个载玻片，制片并镜检孢子囊萌发率，以蒸馏水中的孢子囊萌发为对照。每重复观察不少于400个孢子囊。

结果表明：孢子囊萌发需较高的湿度，湿度低于95 %时不萌发。在相对湿度达98 %和95 %时20 h后的萌发率分别为0.98 %和0.21 %，但在蒸馏水中3 h后的萌发率高达55.6 %。

2.3　碳源对孢子囊萌发的影响

碳源种类为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油。用蒸馏水配制5 %的碳源溶液，18℃下悬滴法培养，以蒸馏水为对照。3，6，9，12 h后镜检孢子囊萌发率。

结果表明：可溶性淀粉对孢子囊的萌发有强烈的促进作用，3 h后对照处理的孢子囊萌发率仅为37.7 %，而可溶性淀粉溶液中的孢子囊萌发率已达90.9 %。此外，蔗糖对孢子囊的萌发也有促进作用，而葡萄糖和甘油对孢子囊萌发无促进作用(见表2)。

表2　不同碳源下孢子囊的萌发率　%

2.4　氮源对孢子囊萌发的影响

配制体积分数为20 %、10 %、5 %的KNO3溶液，18℃下悬滴法培养。不同质量浓度的硝酸钾对孢子囊萌发均有抑制作用，但随着硝酸钾质量浓度的降低，孢子囊的萌发率逐渐提高(见表3)。

表3　不同质量浓度的硝酸钾下孢子囊萌发率　%

2.5　pH值对孢子囊萌发的影响

用磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制4.92～9.18等15个不同pH值梯度的磷酸缓冲液，18℃下悬滴法培养。孢子囊在pH值低于6或高于9时均不萌发，而在6.4～8.0时均可萌发，但都低于蒸馏水中84.5 %的萌发率，因此最适pH值为7.5，而且孢子囊开始萌发较对照处理晚。

结果表明∶不同酸碱度的磷酸缓冲液对孢子囊的萌发均有抑制作用，但随着pH值的增加萌发率也提高(见表4)。

表4　不同pH值对孢子囊萌发率的影响　%

2.6　极端条件对孢子囊萌发的影响

2.6.1低温对离体病叶上孢子囊萌发的影响

取离体叶片上冷冻(-20℃)保存1，3，6 个月的豚草轴霜霉菌孢子囊，配制每毫升5×104个孢子囊的悬浮液，采用悬滴法培养，每处理8个载玻片， 6，12，18，24 h后分别取出2个载玻片，制片并镜检孢子囊萌发率，以蒸馏水中的新鲜孢子囊萌发为对照。

结果表明∶低温(-20℃)降低了霜霉菌孢子囊的萌发力，低温时间越长，孢子囊的萌发力越低。-20℃冷冻保存1，3，6个月的立体叶片上的孢子囊虽然具有一定的萌发力，但是萌发力较对照明显降低(见表5)。

表5　低温对离体病叶上孢子囊萌发率的影响　%

2.6.2干燥对离体病叶上孢子囊萌发的影响

将具大量新鲜霉层的三裂叶豚草叶片采下，放入培养皿(直径为18 cm)中，干燥放置5,15,20,30,60 min后，分别刷下孢子囊，配制每升5×104个孢子囊的悬浮液，采用悬滴法培养，每处理8个载玻片，6，12，18，24 h后分别取出2个载玻片，制片并镜检孢子囊萌发率，以蒸馏水中的新鲜孢子囊萌发为对照。

结果表明∶将离体叶片干燥5 min，其上孢子囊的萌发力略有降低；干燥30 min后，其上孢子囊的萌发力显著降低；干燥60 min，即三裂叶豚草叶片完全干枯，其上的孢子囊不萌发(见表6)。

表6　干燥对离体病叶上孢子囊萌发率的影响　%

3结论与讨论

三裂叶豚草主要分布于中国的辽宁、吉林、黑龙江等省，已成为铁路和公路两侧的优势杂草[6]，危害严重，而入侵的机制尚不清楚，科学合理的防治技术体系还未建立。苍耳轴霜霉菌的发现，为利用病原真菌防治豚草提供了新的途径。向日葵霜霉菌的孢子囊在3～28℃可萌发，最适温度为5～10℃；黄瓜霜霉菌孢子囊在5～30℃围内均可萌发，但最适温度为15～24℃。本实验研究结果表明，三裂叶豚草霜霉菌的孢子囊在5～30℃范围内均可萌发，最适温度为15～20℃，这与向日葵霜霉菌和黄瓜霜霉菌的孢子囊萌发温度有所差异。

采自三裂叶豚草上霜霉菌的孢子囊在室温蒸馏水中的萌发率每次都不相同，这主要与孢子囊的成熟度、标本采集的时间及当时的气候条件对孢子囊形成的影响因素有关。此外，孢子囊在pH值6.4～8.0均可萌发，但萌发率明显降低，表明不同酸碱度的缓冲液均对孢子囊的萌发有抑制作用，但随着pH值的增加萌发率也有提高[7]。

甜瓜种子在播种后分别施用不同量的N、P、K 和6种微量元素，结果证明：低用量的N和K同时施用时，会加重病害的发生[8]。因此，在本文氮源与孢子囊萌发的研究中，选用KNO3作为营养元素，结果表明，低用量的N和K同时施用时，能够促进霜霉菌孢子囊的萌发率，即会加重霜霉病的发生。

碳源中可溶性淀粉对孢子囊的萌发具有明显的促进作用，此外，蔗糖对孢子囊的萌发也具有促进作用，这种促进作用对向日葵霜霉菌孢子囊也同样适用，而不同质量浓度的蔗糖溶液对罂粟霜霉菌的孢子囊萌发无明显刺激作用[9]。

对三裂叶豚草霜霉病菌生物学特性的研究，可进一步了解病害的发生、发展及致病机理，为将三裂叶豚草霜霉病菌应用于三裂叶豚草的生物防治提供理论依据。

参考文献：

[1] 关广清，万方浩.豚草及豚草综合治理[M]. 北京：中国科学技术出版社，1994.

[2] 陶爱林，何韶衡.豚草花粉泛过敏源同源基因克隆与序列分析[J].中华微生物学和免疫学杂志，2004，24(3)：169-173.

[3] 余永年.中国真菌志(第六卷)霜霉目[M].北京：科学出版社，1998.

[4] 郝建军，刘延吉.植物生理学实验技术[M].沈阳：辽宁科学出版社，2001.

[5] 国家技术监督局. GB 15699-1995(GB/T 15699-2013)烟草种子霜霉病检疫规程[S].北京：中国标准出版社, 1996：4-17.

[6] 黄宝华.豚草国内的分布及其危害调查[J].植物检疫，1985，1：62-65.

[7] ANILA DOSHI, B LAL THAKORE. Effect of certain environment factors on germination of conidia ofPeronosporaarborescens(Berk) de bary.[J].J Phytol Res, 1993, 6 (1&2): 59.

[8] MAHRISHI R P, SIRADHANA BS, Effect of nutrition on downy mildew disease caused byPseudoperonosporacubensis(Berk.& Curt．) Rostow[J].On Muskmelon , 1988, 27(2): 153-155.

[9] 李金花.罂粟霜霉病病原及其生物学特性[J].中国中药杂志，2002，27(3)：176-179.

(责任编辑邹永红)

Plasmopara Occurring on Ambrosia Trifida L

SUN Xiao-dong1,LV Guo-zhong1*, ZHAO Zhi-hui1,

YANG Hong1, LIU Shao-qin2, SU Dan1

(1.College of Environment and Resources, Dalian Minzu University， Dalian Liaoning 116605, China;

2.School of Accountancy, HeiLongJiang BaYi Agriculture University, Daqing Heilongjiang 163319, China)

Abstract:In the paper, the systemic research on the biological characteristics of downy mildew is conducted. The results show that the preference temperature range for its sporangium germination is from 15 to 20℃ with the optimal temperature of 18℃. Sporangium germination needs higher humidity because humidity is below 95% sporangium fails to germinate. Soluble starch has a strong role in promoting the sporangium germination; after being treated with soluble solution for 3h, the germination rate of sporangium increases from 37.7% to 90.9%. The treatment of sporangium under the condition of low temperature reduces the sporangia germination ability. the longer the processing time is, the lower the germination ability is. Under the condition of constant temperature, within the scope of 10 ℃~20 ℃, with the increase of temperature, downy mildew infection ability enhances. When the moisturizing time is less than 2h, downy mildew can’t infect Ambrosia trifida, which shows humidity condition is the important factor affecting the morbidity of Ambrosia trifida.

Key words:ambrosia trifida L; plasmopara angustiterminalis Novotelnova; biological characteristics

中图分类号：Q939.95

文献标志码：A

文章编号：2096-1383(2016)01-0015-04

作者简介：孙晓东(1979-) ，女，辽宁丹东人，工程师，主要从事真菌分类与真菌资源利用研究。

基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(DC120101154，DC120101152)。

收稿日期：2015-01-16；最后修回日期：2015-06-01