三氯生对东北林蛙蝌蚪的急慢性毒性分析

董玉瑛，王　翔，邹学军，李晓博

(大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116605)



三氯生对东北林蛙蝌蚪的急慢性毒性分析

董玉瑛，王翔，邹学军，李晓博

(大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116605)

摘要：采用静置驯养-暴露方法测定了东北林蛙蝌蚪在不同质量浓度梯度三氯生中的急、慢性毒性，由剂量-效应关系获得其24 h-LC50和48 h-LC50值分别为1.578 mg·L-1和1.102 mg·L-1，48 h最大无致死效应质量浓度为0.8 mg·L-1；进一步测定了蝌蚪暴露在最大无致死效应质量浓度下11 d期间体内的过氧化氢酶活性动力学变化特征。结果显示，暴露2 d时蝌蚪体内过氧化氢酶活性升高3.5 %，产生了氧化胁迫作用，暴露7 d时过氧化氢酶活性升高49.9 %，达到峰值，之后呈现逐渐降低趋势但仍高于正常值。鉴于三氯生对蝌蚪的慢性损害和长期毒性明显存在，其对生态环境的综合影响将不容忽视。

关键词：三氯生；东北林蛙蝌蚪；急性毒性；亚慢性毒性；过氧化氢酶活性

抗生素、止疼剂、消毒剂、降脂剂和防腐剂等药品和个人护理品(PPCPs)是与人类关系密切、应用广泛、种类繁多的一大类新型污染物。由于其全球使用量大，在许多水环境中被检测的频率高，研究PPCPs对生物的毒理效应成为了重点关注的方向之一[1-2]。三氯生是一种高效广谱抗菌剂，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌以及病毒均有广泛高效的杀灭抑制作用，被广泛应用于化妆品、牙膏、香皂等各种清洁卫生产品中[3]。目前针对三氯生的生态毒性研究主要集中在急性毒性研究，而对其长期的生态毒性和受试生物体内酶活的影响研究报道较少，因此，对其进行亚慢性毒性分析并获得基础毒性数据对于制定该类化合物的环境标准和安全阈值、评估水生生态环境的风险、预防和处理突发事件具有重要意义[4]。

两栖动物是整个生态系统食物链中的一个重要环节。蛙类是一种重要的两栖动物，其幼体蝌蚪对水环境变化非常敏感[5-6]，可用于指示水体不同污染程度。本文研究三氯生对东北林蛙蝌蚪的生态毒理效应，可为该化合物环境风险评价提供相关数据。

1材料与方法

1.1　仪器及试剂

CP114型电子天平(奥豪斯仪器厂)；85-2型磁力加热搅拌器(上海司乐仪器厂)；UV-2600型紫外可见分光光度计(日本SHIMADZU CORPORATION)；TGL-16M台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

三氯生、30 %冰乙酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、0.2 mol·L-1磷酸盐缓冲液pH=6.4(由4 mol·L-1磷酸二氢钠和1 mol·L-1磷酸氢二钠配制而成)、20 mmol·L-1H2O2均为分析纯。

1.2　方法

1.2.1东北林蛙蝌蚪驯养及预实验

受试生物采集于大连开发区童牛岭，经鉴定系为东北林蛙蝌蚪。将其置于24 h曝气后的自来水中驯养3 d。在暴露实验前一天不予喂食。以曝气水为空白对照，配置不同质量浓度梯度的三氯生溶液，按照每升水6尾蝌蚪的比例进行暴露实验，平行3~5组，实验期间不投食，记录24 h和48 h各组蝌蚪的死亡情况，特别观察零死亡的最大剂量和全部死亡的最小剂量，以便确定正式实验的质量浓度梯度。

1.2.2三氯生对东北林蛙蝌蚪急性毒性实验

通过预试验调整质量浓度梯度，并以同样的投加方式再次进行试验，24 h后测一次蝌蚪死亡数量，48 h后测一次蝌蚪死亡数量，最终可以确定三氯生对东北林蛙蝌蚪的半数致死浓度(LC50)。根据水生生物急性毒性试验标准方法在预试验得到的质量浓度范围内，按照等间距的方式，设置三氯生的5组质量浓度梯度(0.2，0.5，0.8，1.1，2.0 mg·L-1)对东北林蛙蝌蚪进行染毒。设空白对照组与平行试验组，每组中放入8尾蝌蚪，用暴露实验法，24 h和48 h后纪录各组蝌蚪的死亡数。

1.2.3三氯生对东北林蛙蝌蚪亚慢性毒性实验

选用5周龄以上蝌蚪，三氯生药品质量浓度为0.8 mg·L-1，设置6个实验组，每组放置10尾蝌蚪，并设置去氯曝气水的空白对照及平行实验。分别于0,2,4,7,11,16 d取样，每组取4尾蝌蚪作为平行，用蒸馏水将其冲洗后迅速擦干，称重并测量体长、头围，观察其活动状态。

1.2.4三氯生对东北林蛙蝌蚪的过氧化氢酶(CAT)活性影响[7-8]

将蝌蚪样品、0.1 g PVPP和20 mL 0.2mol·L-1的磷酸盐缓冲液混合于研钵中，在冰浴条件下研磨后转移，以10 000 r·min-1、4℃条件下离心30 min，取上清液置于-80℃保存备用。在25℃条件下，将3 mL 20 mmol·L-1H2O2和500 μL酶液加入试管中迅速摇匀后，以蒸馏水为参比，测240 nm下3 min期间的吸光度值，间隔1s读数一次。制作混合物的吸光度OD240值随时间变化曲线，根据线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD240。以每克蝌蚪样品(鲜重)每分钟吸光度变化值减少0.01为1个过氧化氢酶活性单位计算过氧化氢酶活性，1个过氧化氢酶活性单位(U)表示为0.01△OD240/min·mg蛋白质。

2结果与讨论

2.1　三氯生对东北林蛙蝌蚪急性毒性分析

进行三氯生对东北林蛙蝌蚪24 h和48 h急性毒性分析，数据拟合结果如图1和图2。计算获得24h-LC50为1.578 mg·L-1，48h- LC50为1.102 mg·L-1，折合东北林蛙蝌蚪单位重量对三氯生的48 h毒性承载力LC50为5 510 mg·kg-1。有研究表明，三氯生对小鼠口服喂食情况下单位重量的毒性承载力LC50为3 700 mg·kg-1、腹腔注射条件下单位重量的毒性承载力LC50为89 mg·kg-1，并且已对小鼠具有轻度致畸性，损伤到肌肉功能，引起了肝癌和肝脏纤维化[9]。由此可知，三氯生对两栖动物和哺乳动物的急性毒性效应显著。

图1　三氯生对蝌蚪暴露24 h剂量-效应关系

图2　三氯生对蝌蚪暴露48 h剂量-效应关系

2.2　三氯生对东北林蛙蝌蚪发育体征影响

观察三氯生对东北林蛙蝌蚪暴露在最大无致死效应质量浓度为0.8 mg·L-1溶液中11 d期间亚慢性毒性情况如图3和图4，显示了其对蝌蚪体长、头围及体重的影响。空白对照组蝌蚪平均体长由2.83 cm增长到3.14 cm，实验期间尾部逐渐萎缩，16 d后蝌蚪尾部消失变成青蛙；三氯生暴露实验组蝌蚪平均体长基本无变化，发育缓慢。空白对照组蝌蚪平均头围由1.86 cm增到2.04 cm；三氯生暴露实验组蝌蚪平均头围由1.86 cm降到1.66 cm，头围明显变小。空白对照组蝌蚪平均体重由208.1 mg增到251.1 mg，体重呈明显增长趋势；三氯生暴露实验组蝌蚪平均体重由208.1 mg降到112.0 mg，体重显著减少。三氯生暴露实验组蝌蚪在暴露期间7 d后陆续出现死亡，且存活的蝌蚪活动性明显减弱。

图3　蝌蚪暴露期间体长和头围的变化情况

图4　蝌蚪暴露期间体重的变化情况

Nik Veldhoen等人研究了布洛芬对成长中的中北美牛蛙蝌蚪的毒性效应，发现只要暴露浓度在10-9范围，即可引起蝌蚪体内和体外培养器官的分子反应。中北美牛蛙蝌蚪在1 5μg·L-1布洛芬环境下暴露6 d，可以改变其肝脏中mRNA转录过程[10]。对比研究说明，布洛芬为内服药物，三氯生多为外用抗菌剂，暴露浓度在10-7范围中三氯生即可抑制蝌蚪变态发育，对蝌蚪的胁迫性较大。

2.3　三氯生对东北林蛙蝌蚪体内过氧化氢酶(CAT)活性的影响

进行三氯生对东北林蛙蝌蚪在最大无致死效应质量浓度0.8 mg·L-1下暴露11d期间过氧化氢酶活性动力学特征的研究，其体内过氧化氢酶活性变化趋势见表1。从表1中可以看出，三氯生暴露实验组过氧化氢酶活性均比空白对照组高，从第2 d到第7 d，三氯生暴露实验组的过氧化氢酶活性升高较快，7 d后酶活性降低；空白对照组酶活性基本变化不大。无致死质量浓度0.8 mg·L-1三氯生下长时间暴露，可促使蝌蚪体内过氧化氢酶活性增强。由于过氧化氢酶是蝌蚪体内重要的生物防御系统酶，三氯生已经对蝌蚪产生了氧化胁迫作用，诱导过氧化氢酶活性，提高机体抗氧化能力。因此，蝌蚪体内过氧化氢酶活性增强以后，蝌蚪的防御功能增强，抵抗三氯生的胁迫作用增大。但因为三氯生的胁迫作用太大，而致使蝌蚪在未能完全变态发育前大部分死亡。

表1　三氯生对东北林蛙蝌蚪过氧化氢酶活性的影响

吕玥等人研究了壬基酚对中华大蟾蜍蝌蚪的毒性效应，结果表明暴露于0.010 mg·L-1壬基酚的蝌蚪，其生长发育被极显著抑制；CAT活性表现为先诱导后恢复；处理组DNA损伤水平均显著高于对照组，具有一定的剂量-效应关系[11]。综合对比上述实验数据可知，三氯生对两栖动物的体内过氧化氢酶(CAT)活性的影响同表面活性剂壬基酚相类似，都会诱导其提高，以增强机体防御机制。

3结论

(1) 采用静置驯养-暴露方法测定了东北林蛙蝌蚪在三氯生中的急性毒性，由毒性效应-剂量相关关系，获得 24h-LC50和48 h-LC50毒性效应值分别为1.578 mg·L-1和1.102 mg·L-1，48h最大无致死效应质量浓度为0.8 mg·L-1。

(2) 对蝌蚪长期低浓度的亚慢性毒性实验表明，三氯生对东北林蛙蝌蚪的体长、头围、体重等体征有明显的抑制作用，在实验周期11 d期间，其平均头围缩小了10.7 %，体重减少了46.1 %，体长变化不明显，体形变细，蝌蚪无法完成变态发育。

(3) 三氯生对东北林蛙蝌蚪体内过氧化氢酶(CAT)活性的动力学实验表明，三氯生可对蝌蚪产生氧化胁迫作用，诱导过氧化氢酶活性增大，以提高机体抗氧化能力。但当三氯生的胁迫作用达到一定程度，会致使蝌蚪在未能完全变态发育前大部分死亡。

参考文献：

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[2] PYCKE B FG, ROLL I B, BROWNAWELL B J, et al. Transformation products and human metabolites of Triclocarban and Triclosan in sewage sludge across the United States[J]. Environmental Science and Technology, 2014, 48(14): 7881-7890.

[3] 董玉瑛，仉春华，邹学军，等. 环境因子影响三氯生对蝌蚪毒性作用研究[J]. 大连民族学院学报, 2013, 15 (4): 1-4.

[4] HALDEN R U. Response to comment on the need and speed of regulating Triclosan and Triclocarban in the United States[J]. Environmental Science and Technology, 2014, 48(19): 11023-11024.

[5] 钟碧瑾. 两种有机磷农药对沼水蛙蝌蚪毒理学效应的研究[D]. 福州：福建师范大学, 2011.

[6] 赵志刚, 张志生, 高世祥. 硝基苯对3种中国土著水生生物的毒性[J]. 生态与农村环境学报, 2011, 27(1): 54-59.

[7] 武小燕. 布洛芬、三氯生对黄颡鱼P450酶及抗氧化酶系的毒性效应[D]. 广州：暨南大学, 2012.

[8] 夏亦明, 朱连珍. 血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法[J]. 卫生研究, 1987, 16(4): 29-33.

[9] YUEH M, TANIGUCHI K, EVANS R M. The commonly used antimicrobial additive triclosan is a liver tumor promoter[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111(48): 17200-17205.

[10] VELDHOEN N, SKIRROW R C, HELBING C C, et al. Effects of acute exposure to the nonsteroidal anti-inflammatory drug ibuprofen on the developing north American bullfrog(Rana catesbeiana)tadpole[J]. Environmental Science and Technology, 2014, 48: 10439-10447.

[11] 吕玥, 张迎梅, 杨峰，等 壬基酚对中华大蟾蜍蝌蚪的毒性效应[J]. 农业环境科学学报, 2010, 29(6): 1086-1090.

(责任编辑邹永红)

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《大连民族大学学报》编辑部

2016年1月15日

Analysis on Acute and Sub-chronic Toxicity of

Triclosan to the Northeast Frog Tadpoles

DONG Yu-ying，WANG Xiang，ZOU Xue-jun，LI Xiao-bo

(College of Environment and Resource, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

Abstract:In this paper the stationary tested method was adopted to determine the acute and chronic toxicity of triclosan to the northeast frog tadpoles which were exposed to different concentration gradient of triclosan. The acute data were obtained by effects-dose relationship. 24h-LC50is 1.578mg·L-1and 48h-LC501.102mg·L-1respectively. The largest no lethal effect concentration of triclosan to the tadpoles is 0.8mg·L-1. By kinetics test of catalase activity it can be found that the enzyme activity increased 3.5% in 2 days, and reached the maxium value beyond the blank value with 49.9% in 7 days to indicate the oxidative stress effect. It should be pay more attention to chronic damage, long-term toxicity and comprehensive impact on the ecological environment.

Key words:triclosan；northeast frog tadpole；acute toxicity；sub-chronic toxicity；catalase activity

中图分类号：X503.2

文献标志码：A

文章编号：2096-1383(2016)01-0011-04

作者简介：董玉瑛(1968-)，女，辽宁锦州人，教授，博士，学校优秀学术带头人，主要从事新型污染物风险评价研究。

基金项目：国家自然科学 (21477001)；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(DC201502070302)。

收稿日期：2015-10-26