精浆游离MicroRNA 34—b在特发性少精子症及无精子症中的表达和临床应用

娄江涛+魏任雄+余亮亮+等

[摘要] 目的 研究游离MicroRNA 34-b（miR-34b）在特发性少精子症和特发性无精子症患者精浆中的表达及诊断价值。 方法 收集特发性少精子症、特发性无精子症和同期因女方因素不孕前来检查的生育力评估正常的健康男性精液各20份，采用实时荧光定量PCR检测精浆游离miR-34b的相对含量，通过方差分析统计各组间的差异，并对精浆游离miR-34b在特发性少精子症和特发性无精子症中的诊断价值进行ROC曲线分析。 结果 正常对照组、特发性少精子症组和特发性无精子症组三组间精浆miR-34b表达量差异有高度统计学意义（F=21.44，P<0.01），与正常对照组相比，特发性少精子症组和特发性无精子症组精浆miR-34b表达量显著降低，差异有高度统计学意义（P均<0.01），但特发性少精子症组与特发性无精子症组间精浆miR-34b相对含量差异无统计学意义（P=0.31）。ROC曲线显示miR-34能够较好的区分特发性少精子症组与健康对照组以及特发性无精子症组与健康对照组曲线下面积分别为（AUC）为0.85（95%CI，0.73～0.97）、0.90（95%CI，0.80～0.99）。 结论 miR-34b在特发性少精子症和特发性无精子症患者精浆中明显降低，并对特发性少精子症和特发性无精症子症显示出一定的诊断价值。

[关键词] 特发性少精子症；特发性无精子症；miR-34b；精浆

[中图分类号] R698.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）25-0004-04

The expression and clinical role of seminal plasma free MicroRNA 34-b in patients with idiopathic oligospermia and azoospermia

LOU Jiangtao WEI Renxiong YU Liangliang SHI Bo CUI Yun

Male Division Laboratory， Ningbo Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University， Ningbo 315012， China

[Abstract] Objective To quantify the expression of seminal plasma free miR-34b in patients with idiopathic oligospermia and azoospermia and to analyze the diagnostic value of it. Methods 20 cases semen of Idiopathic oligospermia and azoospermia were collected， respectively. At the same time， 20 cases semen of healthy male with fertility evaluation which because of the woman factor lead to infertility were collected as control group. the relative expression of seminal plasma free miR-34b was detected by real-time fluorescent quantitative PCR， the dates were analyzed by variance analysis， the diagnostic value of seminal plasma free miR-34b in diseases of oligospermia and azoospermia were analyzed by ROC curve. Results The relative expression of seminal plasma free miR-34b in oligospermia group and azoospermia group were decreased compared with normal controls（P<0.01）， while there were not change between oligospermia group and azoospermia group（P=0.31）. ROC curve showed that miR-34b could distinguish between oligospermia disease and healthy control， the azoospermia and healthy control， the area under the curve were 0.85（95%CI，0.73-0.97） and 0.90（95%CI，0.80-0.99）， respectively. Conclusion The expression of miR-34b was decreased obviously in patients with oligospermia and azoospermia，and shows certain diagnostic value.

[Key words] Idiopathic oligospermia； Idiopathic azoospermia； MiR-34b； Seminal plasma

特发性少精子症和特发性无精子症在特发性男性不育中占有较大比重，目前对该疾病的发病机制尚不清楚。microRNA（miRNA）的发现为我们认识疾病开辟了一条新途径，多项研究表明miRNA 与男（雄）性生殖系统密切相关。其中MicroRNA 34-b（miR-34）基因家族参与细胞周期、凋亡的调控，与精子的发生、凋亡关系密切[1，2]。本文旨在研究miR-34b在特发性少精子症及无精子症精浆中的表达，探讨其在该疾病中的可能作用机制，并初步分析其在特发性少精子症和特发性无精子症中的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 病例选择

选取2012年8月～2014年11月来我院男科就诊的特发性少精子症20例，年龄分别为25～39岁，平均（32.1±4.4）岁和特发性无精子症患者20例，年龄26～42岁，平均（31.5±4.5）岁。精液常规分析3次以上且均为少精或3000 r/min离心15 min后显微镜观察均为无精，每次精液检测间隔2个月，排除精液量异常、血精、液化不良、畸形精子症、精液白细胞数≥1×106/mL以及高热病史、自身免疫性疾病和接触化学及放射性物质的相关职业者。另外选择同期因女方因素造成不孕，生育能力评估正常的健康男性20例为正常对照组，年龄25～39岁，平均（29.6±3.4）岁。各组在年龄结构、婚龄等基线资料方面经齐同性检验差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性，所有对象均签署知情同意。

1.2 标本收集与处理

依WHO要求，禁欲3～7 d，洗手排小便后手淫法采集精液，并用干燥消毒的精液采集器收集全部精液，置37℃多维混匀恒温箱，待充分液化后行精液常规检查。3000 r/min离心15 min，取精浆即时测定精浆miR-34b，或置-80℃冰箱保存待用，用以批量测定。

1.3 主要试剂和仪器

WLJY-9000伟力彩色精子检测系统（北京伟力公司），miR-34bTaqmanmiRNA逆转录试剂盒，TaqmanmiRNA qPCR试剂盒，TaqMan small RNA引物（5×），Taq Man small RNA引物（20×）均购自美国ABI有限公司。Trizol购自美国，高速冷冻离心机为美国Beckman Coulter公司Allegra 64R，反转录PCR仪为美国BIO-RAD公司S1000 Thermal Cycler，实时荧光定量PCR仪为美国BIO-RAD公司CFX96。

1.4 精液常规分析

按照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）的要求进行精液分析[3]，待精液液化后应用北京伟力计算机辅助精子分析系统分析精子常规参数。液化时间通过肉眼和显微镜观察相结合的方式进行识别判读。

1.5 精子总RNA 的提取

（1）预处理，取200 μL精浆加入2 μL浓度为100 μg/mL蛋白酶K于37℃水浴箱1 h后，再加入140 μL醋酸钠、60 μL β-巯基乙醇、50 μL PBS和0.024 PVP充分混匀于室温下放置15 min，然后15000 rpm，4℃离心10 min，取上清液用于Trizol法提取RNA。（2）Trizol法提取RNA，取200 μL 预处理的精浆加入1 mL Trizol中充分均匀，将匀浆液倒入1.5 mL离心管中，再依次加入氯仿、异丙醇及95%乙醇，获得总RNA。（3）提取效率评估：应用20 μL DEPC水溶解RNA沉淀，取2 μL总RNA加入98 μL DEPC水稀释后用分光光度计测定A260/A280，比值在1.8～2.0用于后续实验。

1.6 逆转录和Q-PCR

按照TapManmiRNA逆转录试剂说明书将提取的RNA逆转录合成cDNA，目的基因和内参基因引物分别为Taq Manhsa-miR-34b引物（5×）或内参TaqMan U6 sn RNA引物（5×）。合成cDNA后，按照TaqManmiRNA qPCR试剂说明书进行实时荧光定量PCR检测，反应液为TaqMan Universal PCR混合试剂Ⅱ，分别加入Taq Manhsa-miR-34b引物（20×）或内参TaqManU6snRNA引物（20×）进行扩增，以U6的量为内参照，计算miR-34b的相对表达量为，计算公式[4]：△Ct为2Ct（U6）-Ct（miR-34b）。

1.7 统计学处理

采用SPSS17.0软件进行数据分析。经正态性检验，精液质量参数和精浆miR-34b相对表达量符合正态分布，采用（x±s）表示；两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组病例的一般资料及精液常规参数

各组病例的一般精液常规参数比较见表1。

2.2 精浆miRNA-34b在特发性少精子症和非梗阻性无精子症精浆中含量比较

单因素方差分析发现，组间比较差异有统计学意义（F=36.41，P<0.01）。组间两两比较发现，与正常对照组相比，在特发性少精子症和特发性无精子症精浆中miRNA-34b含量明显降低，差异有统计学意义（P均<0.01），但特发性少精子症组与特发性无精子症组间精浆miR-34b相对含量差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 精浆miRNA-34b在各组精浆中的表达分析（x±s）

注：方差齐性检验F=6.465，P=0.003；方差不齐，组间比较采用近似F检验Welch法，F=36.41，P<0.01；组间两两比较采用Dunnetts T3，*正常组与特发性少精子组比较，**正常组与特发性无精子组比较，***特发性无精子症与特发性少精子症组比较

2.3 精浆miRNA-34b对特发性少精子症和特发性无精子证的诊断价值

通过ROC曲线分析发现，精浆miRNA-34b在评价特发性少精子症组和正常对照组的曲线下面积为0.85（95%CI，0.73，0.97），当最佳临界值为0.059，敏感度85.00%，特异度75.00%。见图1。精浆miRNA-34b在评价非梗阻性无精子症组和正常对照组的曲线下面积为0.90（95%CI，0.80，0.99），当最佳临界值为0.056，敏感度90%，特异度80%。见图2。

3 讨论

特发性少精子症及特发性无精子症是导致男性不育的临床难题，其发病原因复杂，机制尚不清楚。目前用于诊断和评估特发性少精症及特发性无精症的主要手段仍然是精液常规分析，此方法学受多种因素影响，很难准确的反应和全面的评估男性生育能力，而且精液常规参数仅能从表观层面反应精液质量，不能从根本上阐述男性不育症发生发展的机制。miRNA是由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的一类非编码单链小分子RNA，大小为22 nt左右，主要通过与靶基因不完全互补结合，进而抑制翻译或促进mRNA聚腺苷酸尾巴的去除等方式调控靶基因的表达。大量研究表明，miRNA在胚胎干细胞和多种成体干细胞的发育、胚胎后期发育、细胞生长和凋亡、血细胞分化、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏发生及免疫系统的调控等过程中发挥着重要。同时它可游离于体液中，血液、唾液、尿液中miRNA已在多种疾病的诊断和预后中显示了独特的价值[5-7]，被认为是一种潜在的很有前途的组织特异性的无创生物标记物。

MicroRNA与男性生殖系统关系密切[8]。精浆中游离RNA含量丰富，明显高于血浆和唾液，并且与精子的发生密切相关[9]。最近研究发现miRNA相关的Dicer酶在精子分化中起重要作用，在睾丸支持细胞中选择性切除Dicer，可导致睾丸功能退化，精子数目减少，并可导致不育。以上说明miRNA可能在精子发生中起到重要的调控作用。

miR-34是一个保守的miRNA家族，在脊椎动物中，由miR-34a，miR-34b和miR-34c 3个同源miRNA分子组成。成熟mir-34b和mir-34c序列分别位于同一主基因原初转录本的内含子1 和外显子2 内[10]。多种研究表明miR-34基因家族与精子发生密切相关，如miR-34c能通过Nanos2提高小鼠精原干细胞的分化[11]，并能通过ATF1基因调控精原细胞的凋亡[12]。另外miR-34家族成员受p53直接调控，同时其还能够通过对某些p53活性调节基因的调控，进而参与p53通路的反馈调节[13-15]，而p53在睾丸组织高度表达，并与精母细胞的分裂和生精细胞的凋亡关系密切[2]，提示miR-34可能通过对p53的调节而影响精子的生成和凋亡。mir-34b和mir-34c前体位于同一主基因内，但目前有关mir-34b与精子发生及发育之间的研究还鲜有报道，本课题研究发现在特发性少精子症患者及特发性无精子症者精浆中miR-34b表达均明显下调（P均<0.01），提示其与精子的发生发育存在紧密联系，但其作用机制以及是否与P53基因存在联系还有待进一步研究。另外通过ROC曲线分析发现，miR-34b表达量可较好区分精子浓度正常组与特发性少精和特发性无精组。而在特发性少精子症组与特发性无精子症组间的表达差异无统计学意义，提示精浆miR-34b在区分特发性少精子症和特发性无精子症方面的可能作用较为有限。

人类miRNAs约占据整个基因组数量的1%，但它们控制并影响人类约1/3的基因表达，使机体内各种蛋白质处在一个恰当的水平，保障机体各器官的正常功能。特发性少精及特发性无精症是导致男性不育的重要原因之一，致病原因复杂，至今对其发病机制尚不清楚。本研究实验数据证实miR-34b与精子密度存在密切联系，提示我们可以miR-34b为切入点，进一步研究其在男性生殖系统内的联系网络和机制，为我们进一步认识特发性少精子症及特发性无精子症症提供思路和基础。

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（收稿日期：2015-03-30）