湖泊和池塘养殖环境对中华绒螯蟹组织中乳酸和活性氧含量的影响

于德山，陆小平，周惠钟，龚叶平， 黄　芳，王　欢，陶　卉，陈　葵,5，徐世清,5

(1.江苏省昆山市农业委员会，江苏苏州　215300；

2.江苏省昆山市水产技术推广站，江苏苏州　215300；

3.苏州市农产品质量安全监测中心，江苏苏州　215006；

4.苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州　215123；

5.苏州大学农业生物技术与生态研究院，江苏苏州　215123)



湖泊和池塘养殖环境对中华绒螯蟹组织中乳酸和活性氧含量的影响

于德山1，陆小平2，周惠钟2，龚叶平2， 黄芳3，王欢4，陶卉4，陈葵4,5，徐世清4,5

(1.江苏省昆山市农业委员会，江苏苏州215300；

2.江苏省昆山市水产技术推广站，江苏苏州215300；

3.苏州市农产品质量安全监测中心，江苏苏州215006；

4.苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123；

5.苏州大学农业生物技术与生态研究院，江苏苏州215123)

摘要：比较了湖泊和池塘养殖环境对中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)组织中乳酸和活性氧含量的影响。结果显示：性腺、肝脏和肌肉组织中的乳酸含量，阳澄湖、太湖养殖蟹显著低于同水系池塘养殖蟹、特级蟹显著低于个体小的等外品蟹、雄蟹低于雌蟹、性腺和肝脏低于肌肉。9—11月份，湖养蟹组织中的乳酸含量较塘养蟹更早、更加快速地降低。肌肉组织中活性氧(ROS)含量测定显示，特级蟹稳定地低于等外品雌蟹，雄蟹低于相同养殖环境中同规格雌蟹。结果表明，乳酸和ROS含量或机体抗氧化能力的指标对于阳澄湖大闸蟹的品质和呈味特色是一个值得关注和深入研究的指标。

关键词：中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)；乳酸;活性氧;阳澄湖

有机酸是水产品呈味物质的主要组成成分，其组成和含量则与其活体代谢及活动有着密切的关系。乳酸和琥珀酸是鱼贝类肌肉中主要的代谢产物[1]。有关乳酸对水产品的质量影响报道主要集中在加工环节的分析,有研究表明乳酸对大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)的呈味有一定的增强作用[3]。中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)肌肉中琥珀酸含量极少[3]，但缺乏乳酸含量的报告。因此，乳酸是中华绒螯蟹等水生动物体内值得关注的对商品质量有一定影响的有机酸。

环境是饲养动物应激反应的主要对象，动物应激过程中容易在体内引发产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[4]。ROS是一类能够使类脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化反应，包括超氧阴离子(O2)、羟自由基(OH)和过氧化氢(H2O2)等，是具有造成细胞死亡和组织病变的活性物质[5]。另一方面，ROS是动物机体中正常的氧代谢副产物，在细胞信号传导和保持机体的稳态中起到很大的作用[6]；环境信号刺激细胞产生的ROS，是无脊椎甲壳动物组织和机体抵抗环境有害微生物、代谢有毒物质的体内细胞信号物质[7-8]。因此，ROS是一个重要的环境与饲养动物生态响应的指示物质。龚志等[9]报道，高pH值环境对中华绒螯蟹抗氧化能力及抗氧化物质虾青素沉积具有显著影响。ROS在畜牧学领域已经被确定是对肉质具有很大影响的物质[10-11]，但在中华绒螯蟹中还没有类似报道。

中华绒螯蟹对于饲养环境非常敏感，饲养环境会直接影响其应激反应程度以及体内乳酸等代谢产物的形成。目前为止，还没有乳酸对中华绒螯蟹呈味影响的研究，也缺乏养殖环境对活体反应和组织中有机酸代谢关系等的分析。鉴于相关研究的空白，本实验调查了阳澄湖地区湖泊和池塘养殖环境中不同性别与不同大小规格中华绒螯蟹多组织中的乳酸和ROS含量，以期为阳澄湖大闸蟹的品质特色研究提供一定的理论参数和技术依据。

1实验材料与方法

1.1实验动物

实验动物为长江下游苏州太湖水域养殖的中华绒鳌蟹，种质资源符合GB/T 19783-2005中华绒螯蟹[12]。于2013年10月下旬；2014年9月下旬(9月)、10月下旬(10月)和11月下旬(11月)固定养殖户采样。采样分级标准按照GB/T 19957-2005地理标志产品 阳澄湖大闸蟹[13]选择特级蟹和体重低于二级蟹的小蟹(简称等外品)，每次采样特级大蟹和等外品小蟹雌、雄各10~15只。阳澄湖东湖围网养殖特级蟹、太湖西山湖区围网养殖特级蟹和阳澄湖东湖水域周边鱼塘养殖特级蟹，分别简称为阳澄湖特级、太湖特级和池塘特级；小蟹样本为阳澄湖东湖围网养殖等外品蟹和等外品阳澄湖东湖周边鱼塘养殖等外品蟹，分别简称阳澄湖等外和池塘等外。体重控制见图1，特级蟹体重标准为雌150~200 g，雄200~250 g；等外品蟹体重标准为雌<100 g，雄<125 g。

实验动物的预处理用清洁布擦干体表水后称重，活体解剖打开甲壳，分离肝胰脏(简称肝脏)、性腺等组织；剪开步足和头胸甲底部内骨骼，刮出肌肉并混合均匀。每个样本(产地、时间、等级、性别)雌雄各取9只蟹，每随机3只蟹合并为1组，每个样本雌雄各重复3组。

图1　实验用中华绒螯蟹体重控制

A，2013年10月下旬按照特级蟹和等外品蟹两类采样；B，2014年全部按照特级蟹要求，在不同时间采样，分别在9月下旬(9月)、10月下旬(10月)和11月下旬(11月)，其中9月下旬因生长不足，体重低于10月与11月样品。n=9。

1.2乳酸含量的测定

准确称取1.000 g性腺、肌肉或肝脏组织碎片样本，加入液氮迅速磨碎。进一步加入生理盐水1 mL，充分研磨后收集至1.5 mL离心管中，12 000 r/min低温(4 ℃)离心15 min；取上清液得到组织粗提液，在-80 ℃条件下冻存备用。组织中乳酸含量的测定采用分光光度法进行。将上述预处理后的组织粗提液按照乳酸测定试剂盒(南京建成，中国)说明书进行。Lambda750紫外分光光度计(PerkinElmer，美国)测定530 nm处吸光度，根据系列反应氢传递使氮蓝四唑(Nitro blue tetrazolium，NBT) 还原生成的紫色呈色物的530 nm吸光度与乳酸含量存在线性关系，按照下列公式计算乳酸含量。以试剂空白作参照，平行测定3次。

1.3活性氧ROS检测

ROS检测使用了试剂盒(南通碧云天，中国)，按照使用说明书完成。生理盐水中解剖出待测组织并快速清洗，其间严格防止接触空气。将清洗后的组织迅速放入氯荧光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)染料溶液中，在黑暗中染色15 min。黑暗中将染色后组织取出，生理盐水洗涤3次，每次5 min；然后将漂洗过的组织放到载玻片上压片，使得组织在载玻片上均匀分布。BX51荧光 DIC 显微镜(OLYMPUS，日本)观察拍照。实验操作均在暗室中进行。

1.4数据处理

数据统计与绘图使用GraphPad Prism v5.0软件。

2结果与分析

2.1湖泊养殖与池塘养殖对中华绒螯蟹组织中乳酸含量的影响

图2　湖泊养殖与池塘养殖对中华绒螯蟹组织中乳酸含量的影响

阳澄湖，阳澄湖东湖围网养殖特级蟹；池塘，阳澄湖东湖水域池塘养殖特级蟹；太湖，太湖西山湖区围网养殖特级蟹。2014年10月25日采样。测定3重复，每个重复的组织来自3只蟹。纵坐标示单位组织鲜重的乳酸含量。*，P<0.05；**，P<0.01

从图2结果可见，无论是雌性(图2A)还是雄性(图2B)，池塘养殖蟹体内的乳酸含量显著高于阳澄湖或太湖围网养殖蟹，在性腺、肝脏和肌肉中呈现非常一致的趋势。从不同组织看，肌肉中的乳酸含量相对高于肝脏和性腺。从性别看，肌肉和性腺中乳酸含量在性别间差异不大，但肝脏中的乳酸含量雄性有高于雌性的趋势，特别是池塘养殖蟹更加明显。太湖雌蟹肝脏中的乳酸含量高于阳澄湖蟹，其他组织中的乳酸含量则差异不显著。

阳澄湖、阳澄湖东湖水域池塘与太湖同属太湖水系，基本水质上的差异不是十分显著。可以推测，阳澄湖和太湖围网小环境之间，以及池塘水环境与湖泊围网小区域水环境之间的一定差异应该是可能的。另一方面，不同养殖户的养殖方式，以及饵料等的差异应该是存在的。因此，图2结果的乳酸含量差异，还无法简单理解为湖泊养殖蟹与池塘养殖蟹之间的差异。

2.2上市时间对湖泊养殖与池塘养殖中华绒螯蟹组织中乳酸含量的影响

图3结果显示了不同上市时间阳澄湖东湖和阳澄湖东湖水域池塘养殖蟹组织中乳酸含量的变化与差异。可见，不仅湖泊养殖与池塘养殖蟹之间组织中的乳酸含量存在显著差异；同一养殖环境中，在不同时间中华绒螯蟹组织中的乳酸含量也存在显著差异，并且不同组织中的变化规律有差异。在9月下旬至11月下旬之间，湖养蟹组织中的乳酸含量存在降低趋势，11月底调查的3种组织中乳酸含量都降至最低；塘养蟹组织中的乳酸含量则在10月下旬之前还在快速升高，但至11月底，调查的3种组织中乳酸含量也都降至最低。显示9—10月份湖养蟹的组织中乳酸含量低于塘养蟹的结果。

从性别看，雄性湖蟹在9月与10月下旬性腺和肝脏中的乳酸含量都很低，与11月下旬的含量没有显著差异，并且显著低于雌蟹的同组织中含量；只有肌肉中的乳酸含量在11月下旬还有下降。雌性湖蟹在在9月下旬性腺和肝脏中的乳酸含量都较高，随后快速降低。塘蟹无论雌雄，性腺、肝脏和肌肉中的乳酸含量在10月下旬之前快速升高，随后出现下降，其中雄性的变化幅度大于雌性。

图3　采样时间对中华绒螯蟹组织中乳酸含量的影响

湖蟹，阳澄湖东湖围网养殖特级蟹；池蟹，阳澄湖东湖水域池塘养殖特级蟹。测定3重复，每个重复的组织来自3只蟹。纵坐标示单位组织鲜重的乳酸含量，横坐标示采样时间(当月下旬)。*，P<0.05；**，P<0.01。

2.3中华绒螯蟹发育与组织中乳酸含量的差异分析

图3结果显示，上市时间对中华绒螯蟹组织中乳酸的含量有显著影响，说明蟹的发育发育状态与组织中的乳酸含量有一定关系。为此，我们可以从图4不同规格中华绒螯蟹的组织中乳酸含量差异得到进一步证实。图4是我们在图2和图3之前2013年开展的调查，最初的目的是为了探讨组织中乳酸含量与不同规格蟹呈味差异的关系。

图4　不同规格中华绒螯蟹的组织中乳酸含量差异

2013年10月下旬采样。测定3重复，每个重复的组织来自3只蟹。纵坐标示单位组织鲜重的乳酸含量，横坐标示样品蟹的规格。塘蟹与湖蟹的养殖户与养殖地与图2和图3(2014年)的相应样品相同。*，P<0.05；**，P<0.01。

塘养蟹雌蟹的3个调查组织中，乳酸含量都显著高于相同规格的湖蟹；特级雄蟹的性腺和肝脏中也存在这种趋势；这进一步说明湖泊与池塘养殖环境，对中华绒螯蟹组织中乳酸的含量有显著影响。

从组织差异看，肌肉组织中的乳酸含量高于肝脏和性腺，这与2014年调查的图2和图3结果一致；从性别看，同一组织、相同养殖环境与相近大小(规格)蟹的雌雄之间差异不大，这与2014年10月份的调查结果(图2和图3)一致。

比较不同大小(规格)蟹的组织中乳酸含量，性腺(图4A)、肝脏(图4B)和肌肉(图4C)组织中都有一致的个体较小的等外品蟹高于特级蟹的趋势。其中具有可比性的相同养殖环境中，湖养蟹还是塘养蟹，等外品蟹雌蟹的组织中乳酸含量都显著高于特级蟹；湖养的雄性性腺和肝脏组织中，塘养的性腺和肌肉组织中，乳酸含量也显著高于特级蟹。

2.4中华绒螯蟹发育与组织中活性氧的差异分析

图5结果显示，无论塘养蟹还是湖养蟹，个体较小的等外品雌蟹肌肉组织中活性氧(ROS)含量稳定地显示高于特级蟹；雄性肌肉组织中等外品的ROS含量有高于特级蟹的趋势，而雄性塘蟹表现不明显。我们同时调查了性腺和肝脏组织中的ROS含量，未呈现出与规格和养殖环境的稳定关系或变化趋势，结果未列。

3讨论

养殖水域环境对中华绒螯蟹的生长发育和品质有重要影响[14-16]。苏州阳澄湖大闸蟹是著名的地理产品，我们在对阳澄湖地区湖泊和池塘不同养殖环境中中华绒螯蟹的生长发育、营养和呈味成分分析过程中，观察到不同养殖环境中中华绒螯蟹组织中的乳酸和ROS含量存在显著差异。

乳酸含量与缺氧代谢有关，Tao等[17]证实，甲壳动物体内乳酸含量的升高与逆境环境、甚至机体早期经历的逆境环境有关，即使动物脱离了逆境环境，机体仍然通过预设的糖类代谢通路变化而生成乳酸，这是动物主动适应环境压力的一种表现。因此，乳酸含量从一定程度上是机体生长发育过程的逆境环境的生化指标。本实验通过2年的调查，观察到阳澄湖蟹的组织中乳酸含量显著低于同水系池塘养殖蟹；个体较小的等外品蟹显著高于相同环境养殖的特级蟹；9—10月份，湖养蟹组织中的乳酸含量较塘养蟹更早、更加快速地降低；肌肉组织中乳酸含量显著高于肝脏和性腺，而塘养蟹肝脏组织中乳酸有异常升高的表现；个体较小的等外品雌蟹肌肉组织中活性氧(ROS)含量稳定地显示高于特级蟹；雄蟹组织中的乳酸含量和ROS水平低于相同养殖环境中同规格雌蟹等一系列结果。表明，乳酸含量对于消费者品尝口味十分讲究的阳澄湖大闸蟹的品质和呈味特色是一个值得关注的因素，而ROS含量或机体抗氧化能力的指标，是一个值得进一步深入研究的内容。

图5　中华绒螯蟹发育与组织中活性氧的差异分析

2014年10月25日采样，塘蟹与湖蟹的养殖户与养殖地与图2和图3相应样品一致。重复检测2只蟹的肌肉组织。图中淡色部分为ROS染色，灰度越低，表示ROS含量越高。

参考文献：

[1]陈丽花.中国对虾风味成分分析及其天然仿真风味料研究[D].上海:上海海洋大学,2008.

[2]卢春霞.养殖大黄鱼脱脂脱腥工艺优化及风味成分研究[D].杭州:浙江工商大学,2011.

[3]陈德慰.熟制大闸蟹风味及冷冻加工技术的研究[D].江苏:江南大学,2007.

[4]Aleksei V E,Marina S K,Svetlana V K,et al.Oxidized extracellular DNA as a stress signal in human cells[J].Oxid Med Cell Longev,2013,2013:649-747.

[5]Rio P J,Henricus J D,Paul M V,et al.Oxidative stress and pathological changes after coronary artery interventions[J].J Am Coll Cardiol,2013,61(14):1471-1481.

[6]Hiroko M,Kazumi I,Narumi O,et al.ROS are required for mouse spermatogonial stem cell self-renewal[J].Cell,2013,12:774-786.

[7]Fang Y,Wang H,Zhu W,et al.Antioxidative properties of 4-methylumbelliferone are related to antibacterial activity in the silkworm (Bombyxmori) digestive tract[J].Comp Physiol B,2014,184(6):699-708.

[8]Liu T,Xing R,Zhou Y F,et al.Hematopoiesis toxicity induced by CdTe quantum dots determined in an invertebrate model organism[J].Biomaterials.2014,35(9):2942-2951.

[9]龚志,蔡春芳,朱健明,等.高pH值对中华绒螯蟹抗氧化能力及虾青素沉积的影响[J].淡水渔业,2015,45(1):20-24.

[10]Zhang W,Xiao S,Ahn D U.Protein oxidation:basic principles and implications for meat quality[J].Crit Rev Food Sci Nutr,2013;53(11):1191-1201.

[11]Xiao S,Zhang W G,Lee E J,et al.Effects of diet,packaging,and irradiation on protein oxidation,lipid oxidation,and color of raw broiler thigh meat during refrigerated storage[J].Poult Sci.2011,90(6):1348-1357.

[12]李思发,赵金良,邹曙明,等.GBT 19783-2005中华绒螯蟹[S].北京:中国标准出版社,2005:1-6.

[13]陈文怡,许健儿,凌志纯,等.GBT 19957-2005地理标志产品 阳澄湖大闸蟹[S].北京:中国标准出版社,2005:1-2.

[14]韦众,鲍传和.池塘养殖与湖泊放流河蟹的性腺肝脏指数比较[J].淡水渔业,1999,29(9):16-17.

[15]李思发,王成辉,赵乃刚.湖泊放养长江水系中华绒螯蟹的性成熟规律研究[J].水生生物学报,2001,25(4):350-357.

[16]朱清顺,柏如发.不同湖泊养殖中华绒螯蟹脂肪酸组成比较分析[J].水产渔业科学,2007,(7):602-607.

[17]Tao H,Liu H J,Cheng Y Q,et al.Parental environmental exposure leads to glycometabolic disturbances that affect fertilization of eggs in the silkwormBombyxmori:the parental transcript legacy[J].Comp Physiol B.2015,185(1):47-55.

(责任编辑：张潇峮)

Effects of different aquaculture environment in lake or pond on the contents

of lactic acid and reactive oxygen species in tissues of Eriocheir sinensis

YU De-Shan1,LU Xiao-Ping2,ZHOU Hui-Zhong,GONG Ye-Ping2,HUANG Fang3,

WANG Huan4,TAO Hui4,CHEN Kui4,5,XU Shi-Qing4,5

(1.KunshanMunicipalAgricultureCommittee,Kunshan215300,Jiangsu,China;

2.KunshanFisheriesGuidanceStation,Kunshan215300,Jiangsu,China;

3.SuzhouMunicipalExaminationCenterforQualitySafetyofAgriculturalProducts,Suzhou215006,Jiangsu,China;

4.SchoolofBiologyandBasicMedicalSciences,SoochowUniversity,Suzhou,215123,Jiangsu,China;

5.InstituteofAgriculturalBiotechnology&Ecology,SoochowUniversity,Suzhou215123,Jiangsu,China)

Abstract：The lactic acid and ROS content in tissues ofEriocheirsinensisraised in lake and pond were investigated in this paper.The results showed that,the lactic acid content in gonad,liver and muscle from Lake Crabs,no matter Yangcheng Lake or Taihu Lake,were extremely lower than that from pond around the lakes,while the lactic acid content of the top grade mature crabs were lower than that in small crabs.At the same time,lactic acid content in male were lower than that in female,and the lactic acid existed more in muscles than in the other two kinds of tissue.Moreover,the lactic acid in tissues fell earlier and more rapidly in lake crabs than that in pond crabs from September to November.The ROS detection in muscle reveals that the top grade mature crabs contain less ROS than small female crabs,and the male one always had less ROS than female one of the same size.The result elucidated that lactic acid,ROS content or the indicator of oxidation resistance could be a matter of concern in the quality and taste of Yangcheng Lake crab,and they deserved atlention and in-depth study.

Key words：Eriocheirsinensis;lactic acid;reactive oxygen species (ROS);Yangcheng Lake

中图分类号：S966.16

文献标识码：A

文章编号：1000-6907-(2016)01-0087-06

作者简介：第一于德山(1966-)，男，高级工程师，副主任，研究方向为水产养殖。通讯作者：徐世清。E-mail:szsqxu@suda.edu.cn

收稿日期：2015-02-28；

修订日期：2015-06-18

资助项目：江苏省昆山市财政资金项目(P113400113)；国家农业部农业标准化实施示范项目(P113401014)