新型GPR40激动剂的合成及其生物活性

黄　晶， 郭　彬， 周先礼

(1. 西南交通大学 生命科学与工程学院，四川 成都　610031； 2. 中国科学院 上海药物研究所，上海　201203)



·研究论文·

通信联系人： 周先礼，教授， E-mail: xxbiochem@163.com

新型GPR40激动剂的合成及其生物活性

黄晶1,2， 郭彬2， 周先礼1*

(1. 西南交通大学 生命科学与工程学院，四川 成都610031； 2. 中国科学院 上海药物研究所，上海201203)

摘要：以丁炔二醇为起始原料，用叔丁基二甲基氯硅烷进行单保护后，与2-(6-羟基-2,3-二氢苯并呋喃)乙酸甲酯经Mitsunobu反应制得2-{6-[4-(叔丁基二甲硅烷氧基)丁-2炔基氧基]-2,3-二氢苯并呋喃}乙酸甲酯(3)； 3脱除保护后与苯酚衍生物发生Mitsunobu反应，随后经水解合成了6个结构新颖的苯并二氢呋喃衍生物(7a~7f)，其结构经1H NMR，13C NMR和HR-EI-MS表征。GPR40激动活性测试结果表明：7a~7f对GPR40均有激动作用，其中7e和7f激动活性最强，EC50分别为0.593 μmol·L-1和0.596 μmol·L-1。

关键词：丁炔二醇； GRP40激动剂； 苯并二氢呋喃衍生物； 合成； 生物活性

全球二型糖尿病(T2DM)患者的数量正在飞速增长，根据国际糖尿病联合会的统计和分析，T2DM患者的数量预计将从2010年的2.85亿增长到2030年的4.38亿[1]。在中国T2DM患者的数量也已攀升到了0.92亿，而且还有1.5亿的潜在患者[2]。面对如此庞大的患者数量，市场上现有的药物远远不能满足需求，并且早期一些治疗糖尿病的药物(如磺酰脲类)往往还伴随着体重增加和低血糖等副作用[3-4]

GPR40(G protein-coupled receptor 40)是一种具有7个跨膜α螺旋结构的G蛋白偶联受体，主要分布于胰腺β细胞、肠道K和L细胞。它能被游离的中长链脂肪酸激活，促使细胞内钙离子浓度升高，进而促进胰岛素释放[5]。加上其调节胰岛素的分泌是血糖依赖型的，因此低血糖风险很低或没有[6]。

Chart 1

Scheme 1

目前，已有一些GPR40激动剂进入临床研究(Chart 1)，其中由日本Takeda公司研发的TAK-875进入到3期临床，但因为潜在的肝毒性于2013年12月终止研究[7]。Amgen公司的AMG-837和Eli Lilly公司的LY2881835也因为安全性问题相继暂停研究[7]。通过对这些化合物分子结构的研究，我们发现它们均含有一个苄氧结构，而有文献报道指出该结构在肝微粒体中会被代谢为苯甲醛或苯甲酸[8-9]，这可能正是引发他们安全性问题的原因。

鉴于此，本文拟用氧炔氧替换苄氧结构，以期获得具有高效激动活性且无毒副作用的化合物。以丁炔二醇为起始原料，用叔丁基二甲基氯硅烷进行单保护后，与2-(6-羟基-2,3-二氢苯并呋喃)乙酸甲酯(2)经Mitsunobu反应制得2-{6-[4-(叔丁基二甲硅烷氧基)丁-2炔基氧基]-2,3-二氢苯并呋喃}乙酸甲酯(3)； 3脱除保护后与苯酚衍生物(5a~5f)发生Mitsunobu反应，随后经水解反应合成了6个新型的苯并二氢呋喃衍生物(7a~7f, Scheme 1)，其结构经1H NMR，13C NMR和HR-EI-MS表征。并测试了其GPR40激动活性。

1实验部分

1.1　仪器与试剂

X-4型显微熔点仪(温度未校正)；Bruker AVANCE-400 MHz型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；Thermo-DFS型质谱仪。

参考文献2[10]方法合成；柱层析硅胶，200~300目，青岛海洋化工厂；其余所用试剂均为化学纯或分析纯。

1.2　合成

(1) 1的合成

将2-丁炔-1,4-二醇15.0 g(174 mmol)溶于四氢呋喃150 mL中，搅拌下加入三乙胺48.7 mL，冰浴冷却至5 ℃以下，缓慢滴加叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)26.2 g(174 mmol)的四氢呋喃(50 mL)溶液，滴毕；撤去冰浴，于室温反应10 h[TLC监测(展开剂：A=PE/EA=5/1，Rf≈0.4)]。加水100 mL稀释，用乙酸乙酯(2×50 mL)萃取，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂后经硅胶柱层析(洗脱剂：A=5/1)纯化得黄色油状液体1 14.6 g，收率41%；1H NMR(CDCl3)δ: 4.34(td,J=1.8 Hz, 0.8 Hz, 2H), 4.29(dt,J=2.6 Hz, 1.3 Hz, 2H), 0.90(s, 9H), 0.11(s, 6H); EI-MSm/z: 200[M+]。

(2) 3的合成

在反应瓶中依次加入甲苯100 mL， 1 5.0 g(24.5 mmol), 2 5.4 g(25.7 mmol)和三正丁基膦7.9 g，搅拌5 min，氩气保护，加入偶氮二甲酰二哌啶(ADDP)9.9 g，于室温反应14 h[TLC监测(展开剂：A=5/1)]。依次用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂后经硅胶柱层析(洗脱剂：A=10/1)纯化得无色油状液体3 5.15 g，收率53.9%；1H NMR(CDCl3)δ： 7.08(dd,J=8.0 Hz, 0.5 Hz, 1H), 6.54~6.48(m, 2H), 4.84~4.77(m, 1H), 4.72(t,J=1.7 Hz, 2H), 4.40(t,J=1.8 Hz, 2H), 4.32(ddd,J=9.2 Hz, 6.1 Hz, 3.3 Hz, 1H), 3.90~3.81(m, 1H), 3.77(s, 3H), 2.80(dd,J=16.5 Hz, 5.5 Hz, 1H), 2.61(dd,J=16.5 Hz, 9.3 Hz, 1H), 0.94(s, 9H), 0.14(s, 6H); EI-MSm/z: 390[M+]。

(3) 4的合成

将3 5.1 g(13.1 mmol)溶于四氢呋喃80 mL中，冰浴冷却至5 ℃以下，滴加1 mol·L-1TBAF的四氢呋喃(26 mL)溶液，滴毕；于室温反应1 h[TLC监测(展开剂：A=2/1)]。加水80 mL，用乙酸乙酯(2×50 mL)萃取，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂得淡棕色固体4 3.5 g，收率97%；1H NMR(CDCl3)δ： 7.09(d,J=7.7 Hz, 1H), 6.53~6.48(m, 2H), 4.81(t,J=9.0 Hz, 1H), 4.72(d,J=1.6 Hz, 2H), 4.35(t,J=1.6 Hz, 2H), 4.32(dd,J=9.2 Hz, 6.1 Hz, 1H), 3.90~3.81(m, 1H), 3.77(s, 3H), 2.80(dd,J=16.5 Hz, 5.5 Hz, 1H), 2.65~2.52(m, 1H); EI-MSm/z: 276[M+]。

(4) 6a~6f的合成通法

在反应瓶中依次加入甲苯10 mL， 4 200 mg(0.72 mmol)， 5a~5f 0.94 mmol和三丁基膦233 mg，氩气保护下加入ADDP 291 mg，于室温反应5 h[TLC监测(展开剂：A=5/1)]。蒸除溶剂后经硅胶柱层析(洗脱剂：A=5/1)纯化得无色液体或淡黄色液体6a~6f，收率分别为73%， 85%， 71%， 75%， 80%和88%。

(5) 7a~7f的合成通法

将6a~6f0.5 mmol溶于甲醇10 mL中，加入2 mol·L-1NaOH溶液1 mL，于室温反应4 h[TLC监测(展开剂：A=5/1)]。滴加1 mol·L-1盐酸至pH≈3，加水20 mL，用乙酸乙酯(2×10 mL)萃取，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂后经硅胶柱层析(洗脱剂：DCM/MeOH=15/1)纯化得7a~7f。

7a: 白色固体，收率81%， m.p.137～140 ℃;1H NMRδ:12.36(s, 1H), 7.80~7.73(m, 2H), 7.15~7.08(m, 3H), 6.40(dt,J=3.9 Hz, 2.2 Hz, 2H), 4.99(s, 2H), 4.80(s, 2H), 4.70(t,J=9.1 Hz, 1H), 4.20(dd,J=9.0 Hz, 6.9 Hz, 1H), 3.69(ddd,J=15.0 Hz, 8.8 Hz, 6.3 Hz, 1H), 2.71(dd,J=16.6 Hz, 5.5 Hz, 1H), 2.50~2.46(m, 1H);13C NMRδ: 173.08, 160.58, 160.50, 157.92, 134.08(overlap), 124.53, 122.47, 118.97, 115.86(overlap), 106.79, 103.53, 96.72, 83.31, 81.48, 77.16, 55.92, 55.58, 39.04, 37.04； HR-EI-MSm/z: Calcd for C21H17NO5[M+]363.110 1, found 363.110 6。

7b: 白色固体，收率92%， m.p.84～86 ℃；1H NMRδ: 12.37(s, 1H), 7.34(d,J=7.4 Hz, 1H), 7.32~7.27(m, 1H), 7.08(t,J=7.8 Hz, 2H), 7.00(t,J=7.4 Hz, 1H), 6.40(dd,J=6.0 Hz, 2.2 Hz, 2H), 4.94(s, 2H), 4.78(s, 2H), 4.68(t,J=9.0 Hz, 1H), 4.19(dd,J=8.9 Hz, 6.9 Hz, 1H), 3.82(s, 2H), 3.71~3.63(m, 1H), 2.70(dd,J=16.6 Hz, 5.5 Hz, 1H), 2.48(dd,J=7.9 Hz, 6.1 Hz, 2H);13C NMRδ: 173.57, 161.07, 158.43, 155.10, 129.97, 129.72, 125.01, 122.95, 121.87, 120.00, 119.12, 113.12, 107.21, 97.26, 83.29, 82.63, 77.62, 56.53, 56.16, 39.52, 37.50, 18.35； HR-ESI-MSm/z: Calcd for C22H19NO5Na{[M+Na]+}400.115 5, found 400.115 5。

7c: 白色固体，收率86%， m.p.92～95 ℃；1H NMRδ: 12.37(s, 1H), 7.31 (q,J=7.9 Hz, 1H), 7.10(d,J=8.6 Hz, 1H), 6.87~6.75(m, 3H), 6.42(d,J=5.9 Hz, 2H), 4.89(s, 2H), 4.80(s, 2H), 4.70(t,J=9.0 Hz, 1H), 4.20(dd,J=10.0 Hz, 5.1 Hz, 1H), 3.72~3.66(m, 1H), 2.71(dd,J=16.6 Hz, 5.5 Hz, 1H), 2.54~2.50(m, 1H);13C NMRδ: 173.09, 162.83(d,J=242.8 Hz), 160.62, 158.60(d,J=11.1 Hz), 157.97, 130.61(d,J=10.2 Hz), 124.53, 122.48, 111.10, 107.82(d,J=21.0 Hz), 106.70, 102.40(d,J=25.0 Hz), 96.75, 82.83, 81.91, 77.15, 55.87, 55.63, 39.04, 37.04； HR-EI-MSm/z: Calcd for C20H17O5F[M+]356.105 5, found 356.105 6。

7d: 白色固体，收率87%， m.p.59～61 ℃；1H NMRδ: 12.36(s, 1H), 7.29(t,J=8.2 Hz, 2H), 7.11(d,J=8.7 Hz, 1H), 6.74(td,J=8.4 Hz, 2.2 Hz, 2H), 6.64(t,J=2.2 Hz, 1H), 6.61(dd,J=5.2 Hz, 2.6 Hz, 2H), 6.57(dd,J=8.1 Hz, 2.0 Hz, 1H), 6.44~6.40(m, 2H), 4.86(s, 2H), 4.79(s, 2H), 4.70(t,J=9.0 Hz, 1H), 4.20(dd,J=8.9, 7.0 Hz, 1H), 3.74(s, 3H), 3.72~3.65(m, 1H), 2.71(dd,J=16.6 Hz, 5.5 Hz, 1H), 2.48(m, 1H);13C NMRδ: 173.59, 161.16, 161.12, 159.03, 158.51, 158.03, 157.97, 130.95(overlap), 125.06, 122.98, 111.73, 111.13, 110.49, 109.74, 107.18, 106.08, 105.30, 97.25, 83.15, 82.61, 77.66, 56.18, 55.74, 39.54, 37.53; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C27H24O7Na{[M+Na]+}483.141 4, found 483.142 2。

7e: 白色固体，收率79%， m.p.115～116 ℃；1H NMRδ: 12.36(s, 1H), 7.86(d,J=8.1 Hz, 2H), 7.79(d,J=8.3 Hz, 2H), 7.42(t,J=7.9 Hz, 1H), 7.36~7.28(m, 2H), 7.09~7.01(m, 2H), 6.40(d,J=6.4 Hz, 2H), 4.97(s, 2H), 4.81(s, 2H), 4.67(t,J=9.1 Hz, 1H), 4.18(dd,J=8.8 Hz, 7.1 Hz, 1H), 3.70~3.61(m, 1H), 2.68(dd,J=16.6 Hz, 5.5 Hz, 1H), 2.49~2.43(m, 1H);13C NMRδ: 173.06, 160.61, 158.00, 157.71, 143.87, 140.04, 130.17, 127.82(overlap), 125.68, 125.65, 125.40, 124.52, 123.23, 122.44, 119.99, 115.01, 113.32, 106.64, 96.75, 82.74, 82.30, 77.13, 55.66, 55.57, 39.74, 37.01; HR-EI-MSm/z: Calcd for C27H21O5F3[M+]482.133 6, found 482.134 0。

7f: 白色固体，收率75%， m.p.109～112 ℃；1H NMRδ: 12.39(s, 1H), 7.37~7.31(m, 1H), 7.12~7.07(m, 1H), 6.94~6.91(m, 1H), 6.72~6.69(m, 2H), 6.68(s, 2H), 6.44~6.38(m, 2H), 4.88(s, 2H), 4.78(s, 2H), 4.70(t,J=9.1 Hz, 1H), 4.20(dd,J=9.0 Hz, 6.9 Hz, 1H), 3.75(s, 3H), 3.69(dt,J=21.4 Hz, 7.6 Hz, 1H), 2.71(dd,J=16.7 Hz, 5.5 Hz, 1H), 2.50(dd,J=16.6 Hz, 9.2 Hz, 1H), 1.96(s, 6H);13C NMRδ: 173.58, 161.08, 158.48, 158.37, 157.63, 142.15, 137.00(overlap), 134.12, 129.92, 125.01, 122.91, 122.73, 116.01, 113.65, 113.00(overlap), 107.07, 97.17, 82.92, 82.86, 77.62, 56.13, 55.82, 55.31, 39.50, 37.49, 21.12(overlap); HR-ESI-MSm/z: Calcd for C29H28O6Na{[M+Na]+}495.177 8, found 495.179 2。

1.3　GPR40激动活性测试

通过建立共转GPR40和Gα16的细胞系，使得GPR40受体被激活后能引起Gα16蛋白的活化，进而激活磷脂酶C(PLC)产生三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DAG)， IP3可与细胞内内质网和线粒体上的IP3受体结合，从而引起胞内钙的释放。因此，测定胞内钙的变化可以作为检测GPR40活化状态的方法。按文献[11]方法测试：将稳定表达GPR40/Gα16的HEK293细胞种于96孔板，培养过夜。吸去培液，加入新鲜配制的染料40 μL/孔，于37 ℃培养箱内恒温孵育45 min。将染料吸尽弃去，用新鲜配制的钙缓冲液洗一遍，换上50 μL钙缓冲液。用钙缓冲液将待测化合物稀释至10 mmol·L-1并混匀。用Flextation仪检测，第15 s开始由仪器自动加入25 μL预先配制的待测药物，读取525 nm处荧光值，并通过软件GraphPad Prism处理求得化合物对GPR40的EC50值，重复两次实验取平均值。阳性对照为GPR40内源性配体二十二碳六烯酸(DHA)。

2结果与讨论

2.1　GPR40激动活性

7a~7f的GPR40激动活性测试结果见表1。由表1可见，7a~7f对GPR40都有不同程度的激动活性，其中当Ar为单取代苯环(7a~7c)时，激动活性虽然均强于阳性化合物DHA，但仍整体较弱;而当引入单取代的二苯醚基团(7d)时， 活性有了明显的提高，是DHA的五倍多;当Ar基团为单取代或多取代的联苯(7e和7f)时， 活性有了进一步的提升，EC50分别为0.593 μmol·L-1和0.596 μmol·L-1，表明Ar的大小对活性有较大的影响。

表1　7a~7f的GPR40激动活性

3结论

通过引入氧-丁炔-氧基团替换GPR40激动剂中常见的苄氧基团，并对左边的片段进行结构改造，合成了6个结构新颖的苯并二氢呋喃衍生物(7a~7f)，从结构上消除了苄氧代谢引起毒副作用的可能，其中7e和7f的活性最强，远高于阳性对照DHA，并且7e和7f的联苯基团上可修饰空间较大，具有进一步研究的价值。

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Synthesis and Biological Activities of Novel GPR40 Agonists

HUANG Jing1,2，GUO Bin2，ZHOU Xian-li1*

(1. School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China;

2. Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China)

Abstract：Methyl 2-{6-[4-(tert-butyldimethylsilyloxy)but-2-ynyloxy]-2,3-dihydrobenzofuran-3-yl}acetate(3) was prepared by protection of 2-butyne-1,4-diol with tert-butyldimethylsilyl chloride, then Mitsunobu reaction with methyl 2-(6-hydroxy-2,3-dihydrobenzofuran-3-yl)acetate. Six novel benzo-dihydrofuran derivatives(7a~7f) were synthesized by deprotection, Mitsunobu reaction with phenol derivatives and hydrolysis from 3. The structures were characterized by1H NMR，13C NMR and HR-EI-MS. The activities of 7a~7f were tested in GPR40-transfected HEK293 cells. The results showed that 7a~7f all exhibited agonistic activities on GPR40, 7e and 7f were the most potent componds, with the EC50of 0.593 μmol·L-1and 0.596 μmol·L-1, respectively.

Keywords：2-butyne-1,4-diol； GPR40 agonist; benzo-dihydrofuran derivative； synthesis; biological activity

中图分类号：O626.5； R914.5

文献标志码：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.01.15057

作者简介：黄晶(1990-)，男，汉族，湖南岳阳人，硕士研究生，主要从事药物化学研究。 E-mail: hj0706@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(2140222)

收稿日期：2015-02-10;

修订日期：2016-11-03