P53抑制剂和微管抑制剂对银屑病表皮角质形成细胞糖皮质激素受体核转运的影响

张育华　黄文晖　莫菊彩

(台州市肿瘤医院皮肤科，台州317502)



P53抑制剂和微管抑制剂对银屑病表皮角质形成细胞糖皮质激素受体核转运的影响

张育华黄文晖①莫菊彩②

(台州市肿瘤医院皮肤科，台州317502)

[摘要]目的：探讨P53抑制剂和微管抑制剂对银屑病表皮角质形成细胞糖皮质激素受体(GR)核转运的影响。方法：分离和培养银屑病患者和正常人表皮角质形成细胞，分别与P53抑制剂和微管蛋白抑制剂共培养，加或不加血管内皮细胞生长因子(VEGF)，间接免疫荧光法检测上述因素对GR核转位的影响。结果：VEGF可诱导正常角质形成细胞发生核转位；P53抑制剂抑制了VEGF诱导的GR核转位。与VEGF共培养的角质形成细胞的核转位评分显著低于单纯角质形成细胞的核转运评分，差异有统计学意义(P<0.05)；微管抑制剂可完全将正常表皮角质形成细胞的GR滞留在胞浆中，在加入VEGF后，与单纯微管抑制剂组比较，胞浆中GR并没有明显增多；而微管抑制剂和P53抑制剂共培养，会有少量GR进入角质形成细胞的胞核中。结论：微管介导银屑病角质形成细胞GR的核摄取，P53参与了 GR的核输出。

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，常常伴有冠心病、高血压、代谢综合征等系统性疾病[1]，需积极治疗以改善患者的预后。糖皮质激素具有强大的抗炎作用，为治疗银屑病的最常用药物，虽可有效改善皮损，但停药后容易反弹[2]，故加强对糖皮质激素治疗银屑病机制的研究十分重要。糖皮质激素发挥其抗炎作用，需糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor，GR)的参与，研究发现GR能够在细胞浆和细胞核之间穿梭，但糖皮质激素发挥抗炎作用则需要GR转位至细胞核中[3]。目前研究发现，血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor)可诱导正常表皮角质形成细胞的GR从细胞核内转运至细胞浆中[4]，但是VEGF不能诱导HaCaT细胞核内GR转运到胞浆中。HaCaT细胞与正常表皮角质形成细胞最大的不同在于HaCaT细胞的P53等位基因均发生了突变[5]，提示P53蛋白可能参与了 GR的核质转运过程。微管是一种具有极性的细胞骨架，具有细胞内物质运输的路轨作用，可影响细胞内蛋白转运和细胞运动[6]，故推测微管可能参与了GR的核转运。因此，本研究探讨P53抑制剂和微管抑制剂对银屑病表皮角质形成细胞GR核转运的影响，为进一步了解GR核转运的影响因素，为研制治疗银屑病的新药物提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药品与试剂微管抑制剂、P53抑制剂、碘化丙啶、FITC标记购至美国Sigma公司，VEGF购至美国Pepro Tech公司。

1.1.2仪器CO2培养箱、细胞培养瓶、培养板等细胞培养相关器械购自美国Falcon公司，奥林巴斯荧光显微镜购自北京中仪光科科技发展有限公司。

1.2实验方法

1.2.1标本收集在患者知情同意下，标本取自慢性斑块型银屑病患者皮损区皮肤。患者纳入标准：①重度斑块型银屑病；②银屑病皮损面积和严重程度指数≥10分；③取标本前1个月未曾使用过任何药物治疗。排除标准：心脏、脑、肝、肾、造血系统异常；②合并肿瘤性疾病。共30例银屑病患者，其中男9例，女21例；年龄(42.65±14.43)岁。正常对照组皮肤取自整形外科健康成人，共30例，其中男6例，女24例，年龄(42.43±14.36)岁。银屑病患者与正常对照组的性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所取标本分为两部分，一部分立即置于0.5% dispase分离酶中，4 ℃孵育过夜；另一部分保存在-80℃冰箱中用于免疫荧光检测。

1.2.2细胞培养无菌操作台内分离0.5%分离酶中4 ℃孵育过夜的表皮和真皮，将分离下的表皮置于0.25% 的胰酶中，37℃，10 min。然后用10% 的胎牛血清轻轻吹打表皮,以200目滤网过滤角质形成细胞悬液，1 000 r/min,离心5 min。然后,弃上清,加入defined KSFM,将细胞种植于37℃的5% CO2孵育箱中培养和传代。实验使用第2~3代的细胞。

1.2.3免疫荧光将经冷冻切片机切好的4 μm切片转移到预先处理的盖玻片表面，用4%多聚甲醛室温固定组织切片20 min，PBS洗3次，加入10 mmol/L枸橼酸纳缓冲液95℃，加热20 min，PBS洗3次，加入10%胎牛血清室温封闭1 h，加兔抗人GR抗体(1∶200)4℃过夜。PBS洗3次，加入FITC标记的山羊抗兔二抗(1∶50)避光下室温孵育2 h。PBS洗3次，碘化丙啶复染10 min，封片，在荧光显微镜下观察并评分。

1.2.4核转位评分标准在荧光显微镜下选择5个不同视野进行评分。核内荧光显著弱于胞浆内荧光为0分；核内荧光弱于胞浆内荧光为1 分；核内荧光与胞浆内荧光相当为2 分；核内荧光强于胞浆内荧光为3 分；核内荧光显著强于胞浆内荧光为4 分。最后以5个视野的平均分作为最后得分。

1.2.5P53和微管蛋白抑制剂对表皮角质形成细胞的影响正常和银屑病表皮角质形成细胞与P53和微管蛋白抑制剂孵育24 h，加或不加VEGF，固定细胞后用于免疫荧光检测。

2结果

2.1P53抑制剂对VEGF诱导的GR核转位的影响如图1所示，VEGF诱导正常角质形成细胞发生核转位(A)；VEGF不能抑制HaCaT细胞的GR核转位(B)；P53抑制剂抑制了VEGF诱导的GR核转位(C)。与VEGF共培养的角质形成细胞的核转位评分显著低于单纯角质形成细胞的核转运评分，差异有统计学意义(P<0.05)；与VEGF共培养的 HaCaT细胞和P53抑制剂预处理的角质形成细胞的核转位评分与单纯HaCaT细胞和P53抑制剂预处理的角质形成细胞的核转位评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2微管抑制剂对GR核摄取的影响微管抑制剂可完全将正常表皮角质形成细胞的GR滞留在胞浆中，在加入VEGF后，与单纯微管抑制剂组比较，胞浆中GR并没有明显增多；而微管抑制剂和P53抑制剂共培养，会有少量GR进入角质形成细胞的胞核中，见图2。

图1　P53抑制剂对VEGF诱导的GR核转位的影响Fig.1　Effect of P53 inhibitors on nuclear export of glucocorticoid receptor

表1各组别的核转位评分比较

Tab.1Comparison of nuclear translocation score of each group

GroupsControlVEGFKeratinocytes3.96±0.240.51±0.061)HaCaTcells3.89±0.223.84±0.25Keratinocytes+P53inhibitors3.67±0.193.63±0.17

Note：Compare with the control group,1)P<0.05.

图2　微管抑制剂对GR核摄取的影响Fig.2　Effect of microtubule inhibitors on nuclear uptake of glucocorticoid receptor

3讨论

近年来，虽然有很多治疗银屑病的新药问世，但糖皮质激素由于其较强的抗炎作用，仍为治疗银屑病的一线用药。目前研究已经认识到糖皮质激素发挥作用必须有GR的参与，GR从胞浆转运至胞核才能使糖皮质激素发挥作用[3]。因此，研究银屑病角质形成细胞GR转运的影响因素具有重要意义，有利于开发治疗银屑病的新药。

本研究发现，VEGF诱导正常角质形成细胞发生核转位，但却不能抑制HaCaT细胞的GR核转位，这与既往研究结果相似[4]。HaCaT细胞与正常表皮角质形成细胞最大的不同在于HaCaT细胞的P53等位基因均发生了突变[5]，提示P53蛋白可能参与了 GR的核质转运过程。本研究进一步对正常角质形成细胞与P53抑制剂共培养，提示VEGF却不能诱导GR的核转位，证明P53影响银屑病角质形成细胞GR核转运。

微管是一种具有极性的细胞骨架，具有细胞内物质运输的路轨作用，可影响细胞内蛋白转运和细胞运动[6]，然而，微管在活化GR核转运过程中的作用尚存在争议[7]。虽然有研究提示微管在活化GR核转运过程中的作用[8]，胞浆中GR是沿着细胞骨架通道运动的,与微管结合形成异多聚复合物。但是，在HeLa细胞和大鼠的胸腺细胞中,微管或微丝的破坏并不足以诱导未结合受体的核运输,更不能破坏已结合配体受体的核运输[9]。本研究结果显示，微管功能的破坏足以导致正常表皮角质形成细胞中的GR滞留在胞浆中。在微管抑制预处理的角质形成细胞中,GR不能在胞浆和胞核之间转运穿梭，提示微管抑制剂破坏了正常表皮角质形成细胞中GR的核质转运,并抑制了GR的核摄取。微管蛋白与GR的动态相互作用对于GR从胞浆中运动到细胞核内至关重要。因此，本研究为从微管角度研究治疗银屑病的药物提供了理论依据。然而，本研究尚未探讨加入糖皮质激素和细胞因子对角质形成细胞GR核转运的影响，仍需进一步深入研究。

参考文献：

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[3]Spijker AT,van Rossum EF.Glucocorticoid receptor polymorphisms in major depression.Focus on glucocorticoid sensitivity and neurocognitive functioning[J].Ann N Y Acad Sci,2009,79(11):199-215.

[4]Man XY,Li W,Chen JQ,etal.Impaired nuclear translocation of glucocorticoid receptors:novel findings from psoriatic epidermal keratinocytes[J].Cell Mol Life Sci,2013,70(12):2205-2220.

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[9]Szapary D,Barber T,Dwyer NK,etal.Microtubules are not required for glucocorticoid receptor mediated gene induction[J].J Steroid Biochem Mol Biol,1994,51(3-4):143-148.

[收稿2015-03-20修回2015-06-25]

(编辑倪鹏)

[关键词]银屑病；糖皮质激素受体；P53抑制剂；微管抑制剂

Effect of P53 inhibitors and microtubule inhibitors on nuclear translocation of glucocorticoid receptor in psoriatic epidermal keratinocytes

ZHANGYu-Hua,HUANGWen-Hui,MOJu-Cai.DepartmentofDermatology,TumorHospitalofTaizhou,Taizhou317502,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of P53 inhibitors and microtubule inhibitors on nuclear translocation of glucocorticoid receptor in psoriatic epidermal keratinocytes.Methods: Isolate and culture psoriatic and normal epidermal keratinocytes.The keratinocytes were incubated with P53 inhibitors and microtubule inhibitors with or without vascular endothelial growth factor(VEGF),and then detected the distribution of GR by indirect immunofluorescence.Results: VEGF induced nuclear translocation of GR in normal keratinocytes,and the P53 inhibitor restrained VEGF induced nuclear export of GR in normal keratinocytes.The nuclear translocation score of the keratinocytes cultured with VEGF was significantly lower than that of keratinocytes cultured without VEGF(P<0.05).The microtubule inhibitors could completely detained GR of normal epidermal keratinocytes in the cytoplasm,and there′s no significantly increased of the level of GR in the cytoplasm after putting VEGF into the normal epidermal keratinocytes.While the microtubule inhibitors and P53 inhibitors co-cultured,there will be a small amount of GR into the keratinocyte nuclei.Conclusion: Microtubule mediated uptake of GR,P53 participated nuclear export of GR.

[Key words]Psoriasis;Glucocorticoid receptor;P53 inhibitor;Microtubule inhibitors

作者简介：张育华(1978年- )，男，副主任医师，主要从事皮肤科临床工作，E-mail：zhangyuhuaedu@126.com。

中图分类号R758.63
①台州中西医结合医院皮肤科，台州317500。
②台州市肿瘤医院药剂科，台州317502。

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)01-0101-03

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.022